1、慢病毒生產(chǎn)及使用操作手冊一、實驗流程制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48和72h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。以下內(nèi)容由漢恒生物科技（上海）有限公司精心整理總結。二、實驗材料（一）慢病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pHBLVTM系列質粒。1、載體信息（見附錄）2、細胞株 293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單

2、層細胞。3、菌株 大腸桿菌菌株DH5。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。三、包裝細胞293T細胞的培養(yǎng)（一） 293T細胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，293T細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去殘留的培養(yǎng)基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。3、細胞計數(shù)，將細胞全部晃下，加入 3mL 37 預熱的 10 DMEM，用 10mL 移液管進行吹打

3、，較大力吹打 68 次即可，不留死角，之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10 DMEM，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞于計數(shù)板 中計數(shù)。計數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計數(shù)時，4 大格均計 數(shù)，總數(shù)除以 4（得每大格細胞數(shù)），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實際 n萬/mL 細胞濃度。4、細胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。5、根據(jù)細胞計數(shù)結果加入細胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）,重懸細胞，密度為3 x 106個/ml。6、分裝進

4、細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80超低溫冰箱。7、第二天將細胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄。保存過程中，要不時復蘇細胞檢測細胞存活率，觀察細胞狀態(tài)等。（二）293T細胞的傳代當細胞生長到匯合率達到80%90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。1、消化細胞，方法同細胞凍存。2、細胞離心結束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。3、根據(jù)具體情況，將細胞分到10cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿補足到10ml培養(yǎng)基。4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）293T細胞的復蘇當細胞傳代次數(shù)過多，細胞狀態(tài)變差時，或者細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的

5、細胞進行復蘇。1、設置溫度為3742的水浴。2、查看細胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在12min內(nèi)使細胞溶液完全溶解。3、將細胞溶液轉移到15ml離心管中，并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉入6cm培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細胞生長情況。四、慢病毒包裝和濃縮（一）質粒擴增構建好的慢病毒載體和輔助質粒需經(jīng)過大量抽提，濃度大

6、于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8間方可用以包毒。推薦使用Qiagen大抽試劑盒進行質粒的大量去內(nèi)毒素抽提。（二）傳293T細胞將培養(yǎng)293T細胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37度培養(yǎng)箱中3-5min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3mL 37度水浴中預熱的10 DMEM，移液槍用10mL移液管進行吹打，較大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準培口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細胞。之后，將所有細胞吸出，置于15mL離心管中，取50ul混勻后的細胞于1.5mL eppen

7、dorf管中，加入450ul 10 DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細胞于計數(shù)板中計數(shù)。計數(shù)板上共4大格，每大格16小格。計數(shù)時，4大格均計數(shù)，總數(shù)除以4（得每大格細胞數(shù)），再乘以10（10倍稀釋），即為實際n萬/mL細胞濃度。傳代當天記為第一天，若第二天進行轉染，鋪900-1000萬/T75；若第三天轉染，鋪350-400萬/T75。每瓶T75加10mL 10DMEM培養(yǎng)基。轉染當天觀察細胞密度，80-90滿即可進行轉染。轉染前無需換培養(yǎng)基。（三）做脂轉complexDMEM需在37度水浴中預熱，LipoFiterTM轉染試劑需恢復至室溫方可使用，使用前需搖勻。轉染每瓶T75的co

8、mplex成分如下：pspax10gPMD2G10gpHBLVTM系列載體10g轉染后6h換新鮮培液。注：LipoFiterTM轉染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考LipoFiterTM說明書。（四）病毒收集轉染后48和72h分別兩次收集病毒上清(24h收集后置換新鮮培液)，收集后以0.45 m濾器過濾,于40 mL超速離心管中，4，72000g/min離心120分鐘；（五）病毒重懸和保存500ul 新鮮培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的細胞（一）細胞準備將狀態(tài)良好的目的細胞接種到24孔板，使細胞濃度為1×105/ml細胞，接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不

9、同，一般是保證第二天進行病毒感染的時候細胞匯合率介于50%至70%直接。（二）病毒感染1.polybrene的選擇：Polybrene:是帶正電的小分子，與細胞表面的陰離子結合，提高慢病毒對細胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。Polybrene有一定的細胞毒性，有的細胞對polybrene的毒理反應明顯，因此細胞感染時是否適合polybrene需要摸索；不同細胞對polybrene的敏感度不同，可以用110g/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h內(nèi)細胞無明顯毒性反應為佳，可參考文獻并進行預實驗摸索，polybrene最常用的工作濃度為68g/ml。注： 1）漢恒生物

10、的自產(chǎn)的Polybrene 產(chǎn)品，用戶可用以進行輔助感染。提供的Polybrene母液保存在-20（可保存1年以上），避免反復凍融3次以上，否則活性受影響。4可保存2周。 2）Polybrene預實驗請先以對照病毒進行摸索，部分細胞系MOI及Polybrene 的使用參見附表2。2. 感染細胞最佳MOI的測定MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）是指每個細胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高。對于分裂活躍的細胞，比如Hela、293細胞，MOI=13時，80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染

11、效率較低。需要進行MOI梯度摸索實驗，選擇適合的MOI進行實驗。3.感染步驟按實驗需要將細胞鋪板（比如12孔板）。細胞數(shù)以第2天密度約50%為宜。37 培養(yǎng)過夜。對于Polybrene可施加的細胞：準備完全培養(yǎng)基和 Polybrene混合物，Polybrene 終濃度為摸索得到的最適終濃度。移去培養(yǎng)基并添加 0.5 ml Polybrene/培養(yǎng)基混合物于每孔中（適用于 24 孔板，其他孔板請相應調(diào)整體積。）對于不適用Polybrene的細胞，以上步驟省略，直接進入下面步驟。感染前，從冰箱取出并在37水浴中快速融化病毒，吸去細胞原有培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基，再將病毒原液加入細胞中，輕輕

12、8字混勻。（具體加入的病毒數(shù)可參考附表1）37小體積感染4小時，4小時后補齊培養(yǎng)基至正常體積。（感染時培養(yǎng)基體積表格如下）病毒小培養(yǎng)體積感染表培養(yǎng)皿類型表面積/cm2對應細胞培養(yǎng)液體積病毒感染對應細胞培養(yǎng)液體積96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm 20cm24ml2ml100mm 60cm210ml5ml慢病毒感染4小時后補足至培養(yǎng)體積，感染24小時后換液，腺病毒感染2小時后直接換液感染后第二天（約24小時），吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37培養(yǎng)。

13、 感染后48小時，對于帶GFP報告基因的病毒，可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達效率，對于攜帶Puromycin抗性基因的病毒，換上含適當濃度的Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉導的細胞株（詳見下方）。注意： 溶化的 shRNA 慢病毒顆粒置于冰上。反復凍溶或長時間將病毒顆粒暴露于常溫可使病毒效價降低。4.Puromycin抗性篩選：Puromycin標準的施加終濃度范圍為110g/ml，不同細胞puromycin的工作濃度不同，請查找相關文獻（部分細胞參考用量見下圖），另外請設不感染篩選對照（未經(jīng)過病毒感染的野生型細胞），加入等量等濃度的puromycin。部分細胞puromycin

14、參考值Cell lineSpeciesPuromycin (µg/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB-×××Human1-3HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Human embroyonic stem cells（Human ESCs）Human1更多Puromycin使用濃度更新中，詳情請參考公司網(wǎng)站每2-3天換含puromycin的完全培養(yǎng)液一次，至不

15、感染篩選對照組細胞被puromycin殺光，可進行以下兩步操作（依照具體實驗需要選擇）。不挑取單克?。簩⒏腥静⒑Y選后的細胞進行傳代，并繼續(xù)施加puromycin進行維持性篩選培養(yǎng)。連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細胞株。挑取單克?。簩⒏腥静⒑Y選后的細胞挑選至少5個克隆進行細胞擴增，并繼續(xù)施加puromycin進行維持性篩選培養(yǎng)。擴增完畢后western blot或者QPCR檢測目的蛋白的表達。挑取表達適中的穩(wěn)定細胞株，連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細胞株。5. 感染懸浮細胞上面介紹的是針對貼壁細胞的感染方法，若是懸浮或半懸浮細胞，則需要通過平角離心轉染法，即將適量的病毒液加入細胞培養(yǎng)皿后，封

16、好口，放入平角離心機后，低速（500g-1000g/min）離心1h，然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)即可。若由于實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細胞吹打吸入離心管中，進行低速離心，去掉大部分上清，然后加入適量的病毒液，室溫放置15min（不能超過半小時），然后將細胞和病毒液同時吸出轉入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜后換液即可。6. 對于極難感染的細胞對于極難感染的細胞，如DC（樹突狀細胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24小時后，更換新鮮病毒進行二次感染，可顯著提升感染效率。附1：漢恒生物慢病毒質粒圖譜過表達1.單標記2.雙標記IRES載體慢病毒過表達載體，ZSGreen/puro標記T

17、2A系列載體：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-Puro Luc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc干擾1.單標記2.雙標記IRES系列載體慢病毒shRNA干擾載體，ZSGreen/puro標記T2A系列載體：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-PuroLuc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc特殊用途用于融合蛋白構建 慢病毒載體啟動子替換Tet-on system 慢病毒載體：單病毒系統(tǒng)，無須另外表達rtTA，出毒率低，只做建系用，無法提供病毒Tet-on過表達系統(tǒng)，目的基因插入MCS區(qū)，只

18、在DOX存在下才表達，puro可持續(xù)表達，用于篩選 Tet-on干擾系統(tǒng)，應用mir30的sh-mir結構，與tuboRFP融合表達，加DOX時RFP和sh-mir結構啟動表達，因此會看到加Dox后24小時有熒光出現(xiàn)；puro為持續(xù)表達，用于篩選注意：sh-mir合成非常貴附2：慢病毒滴度測定方法簡介:1、細胞準備 將生長狀態(tài)良好的 293T 細胞消化計數(shù)后稀釋至1x105/ml, 加入96孔板，100ul/孔，為每個病毒準備6個孔。放入37，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、加病毒 第二天，在 EP 管中做3倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備6個1.5mlEP 管，每管加入9

19、0ul 培養(yǎng)液，往第一個管中加入10ul病毒原液，混勻后，吸取10ul 加入第二個管混勻。以此類推，做十個稀釋度（103*10-3）。3、追加培養(yǎng)液第三天，吸去帶有病毒的培養(yǎng)液，在每個孔中再加入100ul 完全培養(yǎng)液，以利于細胞的生長。4、觀察結果并計算滴度第五天，在熒光顯微鏡下觀察結果。滴度（PFU/ml）=細胞數(shù)*熒光百分比*MOI*病毒稀釋倍數(shù)*103附3：漢恒生物目的細胞慢病毒感染復數(shù)（MOI）與體積對應表規(guī)格大約數(shù)目MOI值加入病毒數(shù)量慢病毒MOI摸索時加入的體積梯度/ul96well2-5×10420-500.4-2.5×1064-25ul4；12；2048we

20、ll1-2×10520-500.2-1×10720-100ul20；60；10024well2-3×10520-500.4-1.5×10740-150ul40；120；20012well5×10520-501-2.5×107100-250ul100；300；5006well1-2×10620-500.2-1×1080.2-1ml200；600；100035mmdish1-2×10620-500.2-1×1080.2-1ml200；600；100060mmdish2-4×10620-50

21、0.4-2×1080.4-2ml400；1200；2000100mmdish6-10×10620-501.2-5×1081.2-5ml1200；3600；6000150mmdish1-2×10720-500.2-1×1092-10ml2000；6000；10000慢病毒滴度以108/ml為準，其他滴度需相應換算;大約細胞數(shù)目是根據(jù)80%100%細胞密度估算而出，具體細胞數(shù)請種細胞時進行細胞計數(shù)。注： 1）24板長滿了細胞大約有3×105個細胞。 如果一天后要長到70（2.1×105）， 建議1.21.4×105個細

22、胞。因為細胞剛放進去的前幾個小時需要粘在生長表面及適應新的生長條件，不會達到24小時翻一倍的速度。其他規(guī)格培養(yǎng)可參照此確定相應culture細胞量。2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的縮寫，中文譯為感染復數(shù),實際的含義即為每個細胞被多少個有活力病毒所感染。各種細胞的最適MOI值有差別，請客戶正式實驗前先進行預實驗摸索最適MOI。 附4：慢病毒MOI感染參數(shù)注：不同實驗室由于細胞的來源、代數(shù)和細胞狀態(tài)等因素的影響，MOI值也略有差異，以下數(shù)據(jù)是在細胞感染效率在85-100%細胞狀態(tài)良好的情況下獲得的，僅供參考。 細胞系名稱細胞描述MOI值范圍能否添加po

23、lybreneK562人白血病細胞2040可Jurkat人白血病細胞株5080不可kasumi人白血病細胞株1030不可NB4人白血病細胞株5080不可U937人單核細胞2040可THP-1人單核細胞株5080可GBC-SD人膽囊癌細胞株3050不可H929人多發(fā)性骨髓瘤癥細胞系100150不可H1299人非小細胞性肺癌細胞13可95D人肺巨細胞癌24可A549人肺腺癌2040可SPC-A-1人肺腺癌細胞100150可7402人肝癌細胞1015可Hep 3B人肝癌細胞1030可Hep G2人肝癌細胞1030可SMMC-7721人肝癌細胞1030可Huh-7人肝癌細胞系1030可Hela人宮頸癌

24、細胞株1030可HOS人骨肉瘤細胞系2040可Hep-2人喉癌細胞株1030可HL-60人急性髓系白血病細胞株>100可HT-29人結腸癌細胞1030可PKO人結腸癌細胞24可SW480人結腸癌細胞株1030可DLD-1人結直腸腫瘤細胞株1030可SK-OV-3人卵巢癌細胞株24可SHG-44人腦膠質瘤細胞1030可U251人腦膠質母細胞瘤13可U87人腦星型膠質母細胞瘤13可293T人胚腎上皮細胞13可HUVEC-2C人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞1030可PC-3人前列腺癌細胞2040可MDA-MB-231人乳腺癌細胞1030可MCF-7人乳腺癌細胞株2040不可Tca8113人舌鱗狀細胞癌1

25、030可RPE人視網(wǎng)膜色素上皮細胞1030可AGS人胃癌細胞100150可BGC-823人胃癌細胞100150可SGC-7901人胃癌細胞1030可MKN-28人胃癌細胞株2040可MKN-45人胃低分化腺癌細胞株2040可BxPc-3人胰腺癌細胞2040可CFPAC-1人胰腺癌細胞5080可Panc-1人胰腺癌細胞24可HEC-1-B人子宮內(nèi)膜癌細胞株24可NIH-3T3小鼠成纖維細胞系2040可Raw264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞1030（感染后分化）不可CHO中國倉鼠卵巢細胞2040可HSC-T6大鼠肝星型細胞1030不可C6大鼠腦膠質瘤細胞>100可NRK大鼠腎細胞1030

26、可附5：漢恒生物各病毒載體感染目的細胞比較腺病毒慢病毒逆轉錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時間感染后2h感染后24h感染后24h是否需要篩選不需要，腺病毒感染能力很強需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，慢病毒的感染能力不強需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，逆轉錄病毒的感染能力不強觀察時間如帶有GFP等熒光標簽，24h后可觀察到熒光，36h可達到表達高峰，若不帶有熒光標簽，則需要鑒定帶有GFP等熒光標簽，24h后可以觀察到表達，36h達到高峰，若不帶有熒光標簽，則不可直接觀察到，需要鑒定帶有GFP等熒光標簽，24h后可以觀察到表達，36h達到高峰，若不帶有熒光標簽，則不可直接觀察到，需要鑒定是否需要助轉劑不需要有時需要，但是根據(jù)具體情況操作，因為助轉劑，如polybrene，對細胞的傷害比較大，有的細胞可能承受不了有時需要，但是根據(jù)具體情況操作，因為助轉劑，如polybrene，對細胞的傷害比較大，有的細胞可能承受不了附6：漢恒生物病毒包裝周期表腺病毒慢病毒過表達干擾過表達感染目的序列獲得35天24天目的序列獲得35天24天穿梭質粒構建312天312天重組表達質粒構建812天812天質粒重組510天510天慢病毒包裝510天510天腺病毒包裝1215天1215天病毒濃縮（可選）12天12天大量擴增1215天121