1、1第第16章章 高效液相色譜分析法高效液相色譜分析法high performance liquid chromatograph216-1 16-1 高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn)1. 特點(diǎn)：高壓、高效、高速、自動(dòng)化特點(diǎn)：高壓、高效、高速、自動(dòng)化 與氣相色譜比較：與氣相色譜比較：n適合于分子量大、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣，適合于分子量大、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣， 離子型化合物和高聚物的分離分析。離子型化合物和高聚物的分離分析。n液體流動(dòng)相參與分離過(guò)程，選擇性高。液體流動(dòng)相參與分離過(guò)程，選擇性高。n固定相類(lèi)型多，分析選擇余地大。固定相類(lèi)型多，分析選擇余地大。n較低的柱溫，有

2、利于色譜分離。較低的柱溫，有利于色譜分離。n液體擴(kuò)散性小，縱向擴(kuò)散可忽略。液體擴(kuò)散性小，縱向擴(kuò)散可忽略。n試樣易于制備及回收。試樣易于制備及回收。n儀器復(fù)雜昂貴。儀器復(fù)雜昂貴。n液相色譜高柱效的原因液相色譜高柱效的原因: :以特殊方法用小粒徑的填料（以特殊方法用小粒徑的填料（3 35um5um球形）制備色譜柱球形）制備色譜柱nH=He+Hd+Hm+Hs+Hsm =A+B/u +Cmu+Csu+Csmu 由于溶質(zhì)分子在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)很小，縱向擴(kuò)散由于溶質(zhì)分子在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)很小，縱向擴(kuò)散可以忽略。可以忽略。 因此因此B B項(xiàng)可以略去。項(xiàng)可以略去。nH=A+（Cm+Cs+Csm）unA=2dA

3、=2dp pn 2.液相色譜中速率理論液相色譜中速率理論0.01 k0.01 k2 2 (1+ k(1+ k) )2 2 Cm =dp2 Dm 416-2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀流程及主要部件流程及主要部件流程流程組成系統(tǒng)：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)組成系統(tǒng)：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)516-2-1 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)（1） 高壓輸液泵高壓輸液泵主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：15015035035010105 5 PaPa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙

4、腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 環(huán)環(huán)己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) ) 溶劑強(qiáng)度溶劑強(qiáng)度指溶劑將組分從色譜柱上洗脫下來(lái)的能力。溶劑指溶劑將組分從色譜柱上洗脫下來(lái)的能力。溶劑強(qiáng)度與溶劑的極性有關(guān)。正向色譜中溶劑極性越大溶劑強(qiáng)度強(qiáng)度與溶劑的極性有關(guān)。正向色譜中溶劑極性越大溶劑強(qiáng)度越大。反相色譜反之。越大。反相色譜反之。 17（2 2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸

5、收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。 對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。（3 3）高純度）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線(xiàn)不穩(wěn)，或產(chǎn)生度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線(xiàn)不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽偽峰峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50501OOnm1OOnm。（4 4）化

6、學(xué)穩(wěn)定性好）化學(xué)穩(wěn)定性好。避免與樣品或固定相發(fā)生反應(yīng)或聚合。避免與樣品或固定相發(fā)生反應(yīng)或聚合。（5 5）低粘度）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。（6 6） 試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，若試樣組分的若試樣組分的分配比分配比K K值范圍很廣，則采

7、用梯度洗脫。值范圍很廣，則采用梯度洗脫。18一、液一、液- -固吸附色譜固吸附色譜二、液二、液- -液分配色譜液分配色譜三、化學(xué)鍵合相色譜三、化學(xué)鍵合相色譜四、離子交換色譜四、離子交換色譜五、排阻色譜五、排阻色譜六、親和色譜六、親和色譜( (AC)AC)主要分離類(lèi)型與原理主要分離類(lèi)型與原理1916-3 16-3 液液-固吸附色譜固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是使用的是5 51010mm的硅膠吸附劑；的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相流動(dòng)相：各種不同極性的一

8、元或多元溶劑。：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：非線(xiàn)形等溫吸附常引起峰的拖尾；：非線(xiàn)形等溫吸附常引起峰的拖尾；2016-4 16-4 液液-液分配色譜液分配色譜liquid- liquid partition chromatography 固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理基本

9、原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配組分在固定相和流動(dòng)相上的分配； 流動(dòng)相流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相正相 normal phasenormal phase），），流流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相反相 reverse phasereverse phase）。）。正正相與反相的出峰順序相反；相與反相的出峰順序相反； 固定相固定相：（1 1）全多孔型載體）全多孔型載體 （2 2）表面多孔型載體（薄殼型微珠擔(dān)體）表面多孔型載體（薄殼型微珠擔(dān)體） （3

10、3）固定液）固定液 極性：極性：，-氧二丙腈，聚乙二醇氧二丙腈，聚乙二醇 非極性：十八烷（非極性：十八烷（ODSODS），角鯊?fù)椋?，角鯊?fù)?2116-5 16-5 化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜bonded-phase chromatography1 1鍵合固定相類(lèi)型鍵合固定相類(lèi)型 用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)與有機(jī)分子成鍵與有機(jī)分子成鍵, ,即可得到各種性即可得到各種性能的固定相。一般可分三類(lèi)能的固定相。一般可分三類(lèi)（1 1）疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（如不同鏈長(zhǎng)的烷

11、烴（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等（2 2）極性基團(tuán)極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；鹽； 作為陽(yáng)離子交換作為陽(yáng)離子交換 基團(tuán)的磺酸等基團(tuán)的磺酸等. .22C18硅膠填料結(jié)構(gòu)2316-5 16-5 化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜bonded-phase chromatography 2.2.化學(xué)鍵合固定相特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相特點(diǎn)：（1 1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2 2）

12、壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；（3 3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （4 4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5 5）有利于梯度洗脫；適用于分離容量因子）有利于梯度洗脫；適用于分離容量因子k k值范圍寬的樣品。值范圍寬的樣品。n存在著雙重分離機(jī)制：存在著雙重分離機(jī)制：( (鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理) )n高覆蓋率：分配為主；高覆蓋率：分配為主；n低覆蓋率：吸附為主；低覆蓋率：吸附為主；243反相健合相色譜法反相健合

13、相色譜法 固定相：固定相：極性較小的鍵合固定相，如硅膠極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C-C1818H H3737、硅膠、硅膠- -苯基等；苯基等；流動(dòng)相：流動(dòng)相：極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛- -水、水和無(wú)機(jī)水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。鹽的緩沖溶液等。多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；具有柱效高，能獲多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。分離機(jī)理：分離機(jī)理：疏溶劑作用。把非極性的烷基鍵合相看作一層疏溶劑作用。把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，這

14、種，這種“分分子毛子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性流動(dòng)相來(lái)分離含有有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留極性流動(dòng)相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用。兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行作用。兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。為。25

15、4.4.正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法 固定相固定相: :極性的有機(jī)基團(tuán)，極性的有機(jī)基團(tuán)，CNCN、NHNH2 2雙羥基等（表雙羥基等（表16-416-4）鍵合）鍵合在硅膠表面在硅膠表面；流動(dòng)相流動(dòng)相: :而以非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)）中加入適量的而以非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為分離極性化合物。極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為分離極性化合物。主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類(lèi)型的化合物。不同類(lèi)型的化合物。5.5.離子性鍵合相色譜法離子性鍵合相色譜法 固定相固定相: :

16、當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一種離子交換基團(tuán)，如一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H、一、一CHCH2 2N N（CHCH3 3）等；等； 流動(dòng)相流動(dòng)相: :一般采用緩沖溶液。一般采用緩沖溶液。 分離原理與離子交換色譜類(lèi)同分離原理與離子交換色譜類(lèi)同。2616-6 16-6 離子交換色譜離子交換色譜ion-exchange chromatography 流動(dòng)相流動(dòng)相：陰離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；：陰離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸

17、性水溶液；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液； 基本原理基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：R RSOSO3 3H +MH +M+ + = R = RSOSO3 3 M + H M + H + + 陰離子交換：陰離子交換：R RNRNR4 4OH +XOH +X- - = R = RNRNR4 4 X + OHX + OH- - 應(yīng)用應(yīng)用：

18、離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。27離子交換色譜離子交換色譜分離固定相分離固定相 結(jié)構(gòu)類(lèi)別：結(jié)構(gòu)類(lèi)別：（1 1）薄殼型離子交換樹(shù)脂）薄殼型離子交換樹(shù)脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約面涂約1%1%的離子交換樹(shù)脂；的離子交換樹(shù)脂；（2 2）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)） 樹(shù)脂類(lèi)別（表樹(shù)脂類(lèi)別（表16-616-6）：）：（1 1） 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2 2） 陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿陰離子交換

19、樹(shù)脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）性、弱堿性）2816-7 16-7 排阻色譜色譜排阻色譜色譜size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝膠凝膠(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原理原理：按分子大小分離。按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散（滲透）到凝小分子可以擴(kuò)散（滲透）到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；全部在死體積前出峰；

20、可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-10100-105 5范范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 29 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等；多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植肌?016-8 16-8 親和色譜親和色譜(AC) Affinity chromatograph原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂具有一般反應(yīng)