1、一、紫外分光光度計(jì)工作原理二、紫外分光光度計(jì)構(gòu)造三、 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 質(zhì)量的原理 四、 紫外分光光度計(jì)操作 紫外分光光度計(jì)基本工作原理是用一定頻率的紫外、可見(jiàn)光照射被分析的有機(jī)物質(zhì)，引起分子中價(jià)電子的躍遷，它將有選擇地被吸收。得出的一組隨吸收波長(zhǎng)改變而變化的光譜，可以反映試樣的特征。在紫外光的范圍內(nèi)，對(duì)于一個(gè)特定的波長(zhǎng)，吸收的程度于試樣中該成分的濃度成正比。因此可通過(guò)測(cè)定其吸收度來(lái)得出我們所需。 基本依據(jù)： 單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，即朗伯- 比爾定律，這是吸收光譜法定量的理論依據(jù)。即： A = ECL 式中 A 為吸

2、收度 ； E 為吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度的吸收度數(shù)值； C 為溶液濃度； L 為液層厚度。 基本構(gòu)造主要由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和顯示器五大部分組成。光源光源 單色單色器器 樣品樣品池池 檢測(cè)器檢測(cè)器 顯示器顯示器 在整個(gè)紫外光區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。 紫外區(qū)常為氫燈或氘燈，發(fā)射的連續(xù)波長(zhǎng)范圍是180-360 nm。 單色器是將光源輻射的復(fù)合光分成單色光的光學(xué)裝置。它是分光光度計(jì)的心臟部分。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組成。關(guān)鍵是色散元件，最常見(jiàn)的色散元件是棱鏡和光柵。狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直接關(guān)系到儀器的分辨

3、 率。狹縫越小，光的單色性越好。分為入射狹縫和出射狹縫。棱鏡:玻璃3503200 nm，石英1854000 nm。光柵:波長(zhǎng)范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便。543211.入射狹縫 2.準(zhǔn)直透鏡 3.棱鏡 4.聚焦棱鏡 5.出射狹縫 用于盛裝試液的裝置（或叫比色皿）吸收材料必須能夠透過(guò)所測(cè)光譜范圍的光。一般可見(jiàn)光區(qū)使用玻璃吸收池，紫外光使用石英吸收池。 規(guī)格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。 在高精度的分析測(cè)定中（紫外光區(qū)尤其重要）比色皿要挑選配對(duì)，因?yàn)槠洳牧系谋旧砦馓匦砸约氨壬蟮墓獬涕L(zhǎng)度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。4. 4. 檢測(cè)器檢測(cè)器 利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變

4、成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。 要求靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、噪聲水平低、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。5. 5. 顯示器顯示器 將監(jiān)測(cè)器輸出的信號(hào)放大并顯示出來(lái)的裝置。常用的液晶數(shù)字指示窗口和計(jì)算控制顯示。 核酸分子基本結(jié)構(gòu)是由磷酸、戊糖和堿基組成，其中堿基具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值的波長(zhǎng)為250270 nm。例如腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶的最大紫外線吸收值分別為260.5nm、267nm、264.5nm、259nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不會(huì)發(fā)生改變，但是核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260nm，吸收低谷在230nm，這一特性為測(cè)定核酸質(zhì)

5、量提供了基礎(chǔ)。 而且，我們可以通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的紫外線吸收值。根據(jù)它們的比值來(lái)估算核酸純度：核酸樣品中最常有的其它吸光物質(zhì)為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)在280 nm處具有強(qiáng)吸收峰，因此測(cè)定A260/A280比率，可以判斷DNA的純度。純化的DNA及RNA的A260/A280 比值應(yīng)分別接近1.8 及2.0，當(dāng)溶液中含有蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)造成A260/A280 比值降低。 純DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 儀器的使用操作規(guī)程1.準(zhǔn)備工作1.1清洗比色皿：先在濃硫酸及重鉻酸鉀混合液中浸泡（要注意安全），浸泡一段時(shí)間后先用自來(lái)水洗凈

6、混合液，再用蒸餾水沖洗。洗凈后放入烘干箱干燥。1.2配制待測(cè)樣品與空白對(duì)照。1.3打開(kāi)光度計(jì)主機(jī)電源（預(yù)熱10-15min）。1.4開(kāi)啟計(jì)算機(jī)電源。1.5 雙擊光度計(jì)圖標(biāo)，即啟動(dòng)儀器的控制程序。2.檢測(cè)2.1 點(diǎn)擊選項(xiàng)“應(yīng)用”進(jìn)入DNA檢測(cè)界面。如圖：2.2 設(shè)置參數(shù)：測(cè)量波長(zhǎng)，校正系數(shù)。2.3 將有空白對(duì)照的比色皿放入樣品槽。點(diǎn)擊校零。2.4 校零結(jié)束后，將對(duì)照取出換上待測(cè)樣品比色皿，點(diǎn)擊“測(cè)量”開(kāi)始測(cè)定。3. 檢測(cè)完畢，檢查數(shù)據(jù)是否符合所需，結(jié)果正確可以點(diǎn)擊“導(dǎo)出”保存結(jié)果數(shù)據(jù)。4. 取出比色皿，將比色皿中的溶液到盡（將吸水紙鋪于桌面，將比色皿倒置輕輕磕幾下，以確保除凈殘留）然后用蒸餾水或

7、有機(jī)溶劑沖洗比色皿至干凈放入烘干箱干燥，將儀器外蓋蓋好。5. 退出軟件，關(guān)閉計(jì)算機(jī)；關(guān)閉儀器。1.測(cè)定時(shí)，需選用石英玻璃的比色皿（一般來(lái)說(shuō)，紫外分光光度計(jì)的紫外區(qū)指200400nm，玻璃在300-500nm區(qū)，有非常強(qiáng)的吸收，會(huì)對(duì)被測(cè)樣品造成干擾。必須用在紫外區(qū)無(wú)吸收的昂貴的石英比色皿。）2.測(cè)定時(shí)，如有溶液溢出或其它原因?qū)悠凡叟K，要盡可能及時(shí)清理干凈（注意規(guī)范操作切勿損壞儀器）。每次測(cè)定玩必須清洗比色皿，才能加入第二樣品，以保證準(zhǔn)確性。 3. 如果數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，依次檢查： 校零是否正確（重新校零） ； 參數(shù)設(shè)置是否正確（波長(zhǎng)選擇及校正系數(shù)設(shè)定）； 還有待測(cè)樣品是否搖勻； 比色皿是否放在 正確位置！4.如果數(shù)據(jù)異常（如出現(xiàn)負(fù)值等）： 依次檢查： 比色皿是否用錯(cuò)（測(cè)定紫外光時(shí)，要用石英比色皿！）； 比色皿規(guī)格是否選用正確（0.5ml)； 樣品準(zhǔn)備是否有誤(如有誤，重新準(zhǔn)備樣品）?；蛘邩悠肥欠翊嬖趩?wèn)題（如：樣品時(shí)間過(guò)久DNA缺失、樣品檢測(cè)前沒(méi)有搖勻）5. 清洗比色皿時(shí)一定要注意安全（帶上手套規(guī)范操作）。切記浸泡時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則損壞比色皿；