1、第五章第五章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 第一節(jié)第一節(jié) 植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念和應(yīng)用植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念和應(yīng)用 第二節(jié)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)方法花藥和花粉培養(yǎng)方法 第三節(jié)第三節(jié) 單倍體植株鑒定和染色體加倍單倍體植株鑒定和染色體加倍花藥花藥單倍體胚狀體單倍體胚狀體要求要求了解植物的花藥和藥粉培養(yǎng)概念及應(yīng)用，了解植物的花藥和藥粉培養(yǎng)概念及應(yīng)用，單倍體植株鑒定和染色體加倍技術(shù)；單倍體植株鑒定和染色體加倍技術(shù)；掌握植物的掌握植物的花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)。技術(shù)。講解重點(diǎn)講解重點(diǎn)植物的花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)植物的花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)及影響因素。及影響因素。第一節(jié)第一節(jié) 植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念

2、和應(yīng)用植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念和應(yīng)用 自自1964年年Guha和和Maheshwari首次獲得首次獲得 曼陀羅曼陀羅單倍體植株以來，單倍體植株以來， 已有已有250多種高等植物通過花藥培養(yǎng)得到了多種高等植物通過花藥培養(yǎng)得到了 單倍體植株。其中有近單倍體植株。其中有近1/4的植物種類的的植物種類的 花粉植株是在花粉植株是在我國首次培養(yǎng)成功我國首次培養(yǎng)成功的，的， 包括比較包括比較困難困難的禾本科作物。的禾本科作物。 中國首先應(yīng)用單倍體育種法改良作物品種，中國首先應(yīng)用單倍體育種法改良作物品種， 已育成了一些煙草、水稻、小麥等優(yōu)良已育成了一些煙草、水稻、小麥等優(yōu)良品種品種。 花藥花藥（anther）

3、是植物花的雄性器官，包括）是植物花的雄性器官，包括二倍體二倍體的藥壁和藥隔組織、的藥壁和藥隔組織、單倍體單倍體的雄性細(xì)胞的雄性細(xì)胞花粉粒。花粉粒。 （pollen grain）花藥和花粉培養(yǎng)的概念花藥和花粉培養(yǎng)的概念花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)是指在合成培養(yǎng)基上，是指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而象體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最終發(fā)育成完整而象體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最終發(fā)育成完整植株植株的。的。 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)是將一定發(fā)育期的是將一定發(fā)育期的花藥花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)，進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于就培養(yǎng)方法和技術(shù)

4、來講，屬于器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)的范疇。的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)花粉培養(yǎng)是將處于一定發(fā)育階段的是將處于一定發(fā)育階段的花粉花粉從花藥中分離出來，從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)，也稱為再加以離體培養(yǎng)，也稱為小孢子培養(yǎng)小孢子培養(yǎng)。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。的范疇。 目前，花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在目前，花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應(yīng)用。禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應(yīng)用。作物單倍體只具有單套染色體組，作物單倍體只具有單套染色體組，不能結(jié)實(shí)不能結(jié)實(shí)，本身無利用價(jià)值，本身無利用價(jià)值，

5、但經(jīng)染色體加倍成為但經(jīng)染色體加倍成為雙單倍體雙單倍體（double haploid，DH），），與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合，與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合，就會(huì)顯示出巨大的優(yōu)勢。就會(huì)顯示出巨大的優(yōu)勢。二、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用二、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用育種材料可以縮短育種年限育種材料可以縮短育種年限 常規(guī)育種中，雜交常規(guī)育種中，雜交F2代起會(huì)出現(xiàn)性狀分離，到代起會(huì)出現(xiàn)性狀分離，到F6代才開始選擇，代才開始選擇， 育成一個(gè)品種需育成一個(gè)品種需8-10年年。 單倍體育種中，通過單倍體育種中，通過F1代花藥培養(yǎng)代花藥培養(yǎng)，獲得單倍體植株，獲得單倍體植株， 經(jīng)染色體加倍立即成為純合二倍體，經(jīng)染色體加倍立即成為純合二倍體， 從

6、雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要從雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要2個(gè)個(gè)世代，世代， 育種只需育種只需3-5年年，顯著縮短育種年限顯著縮短育種年限。突變系的篩選突變系的篩選 對(duì)對(duì)花粉花粉進(jìn)行誘變處理，經(jīng)離體培養(yǎng)獲得單倍體植株，進(jìn)行誘變處理，經(jīng)離體培養(yǎng)獲得單倍體植株， 其其表現(xiàn)型表現(xiàn)型和基因型一致，和基因型一致， 突變（無論是顯性或是隱性的）在突變（無論是顯性或是隱性的）在當(dāng)代當(dāng)代植株中就會(huì)表現(xiàn)出來。植株中就會(huì)表現(xiàn)出來。 花藥培養(yǎng)和抗病育種結(jié)合起來，花藥培養(yǎng)和抗病育種結(jié)合起來， 導(dǎo)入抗病基因，是培育抗病品種的有效方法之一。導(dǎo)入抗病基因，是培育抗病品種的有效方法之一。1. 作物育種作物育種

7、2. 物種進(jìn)化研究物種進(jìn)化研究利用單倍體材料可查明其利用單倍體材料可查明其原始親本染色體組原始親本染色體組的構(gòu)成。的構(gòu)成。單倍體單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體染色體的可能性及其數(shù)目和形狀，形成二價(jià)體染色體的可能性及其數(shù)目和形狀，能夠說明能夠說明有無同源染色體有無同源染色體，如發(fā)現(xiàn)大量的如發(fā)現(xiàn)大量的二價(jià)體二價(jià)體，同時(shí)植株表現(xiàn)高度，同時(shí)植株表現(xiàn)高度可育可育性，性，說明核內(nèi)有相同的染色體組，說明核內(nèi)有相同的染色體組，此單倍體植株則是此單倍體植株則是多倍體多倍體。3. 遺傳分析遺傳分析 單倍體是研究單倍體是研究基因基因性質(zhì)及其作用的良好材料。性質(zhì)及其作用的良好材料。 目前在許多植物上

8、應(yīng)用植物單倍體培養(yǎng)技術(shù)目前在許多植物上應(yīng)用植物單倍體培養(yǎng)技術(shù) 已構(gòu)建出已構(gòu)建出DH群體（單倍體加倍獲得的雙單倍體），群體（單倍體加倍獲得的雙單倍體）， 并用于并用于遺傳分析遺傳分析。 以小麥以小麥DH群體群體（旱選（旱選10號(hào)號(hào)魯麥魯麥14）為材料，）為材料， 在水分脅迫及非脅迫兩種條件下在水分脅迫及非脅迫兩種條件下 考察水培幼苗的單株根數(shù)、最大根長、根鮮重、根干重、考察水培幼苗的單株根數(shù)、最大根長、根鮮重、根干重、 根莖鮮重比及根莖干重比等根莖鮮重比及根莖干重比等根系性狀根系性狀。 應(yīng)用基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法應(yīng)用基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法 分析幼苗根系性狀的分析幼苗根系性狀的

9、QTL，以及基因與環(huán)境的，以及基因與環(huán)境的互作互作。 4. 分子生物學(xué)分子生物學(xué)為構(gòu)建為構(gòu)建RFLP和和RAPD連鎖圖連鎖圖，需要建立合適的作圖群體需要建立合適的作圖群體（大致分為（大致分為4類）類）（1）基于單交產(chǎn)生的）基于單交產(chǎn)生的F2群體群體 F2易配制，易配制， 提供給遺傳分析的信息最為豐富，提供給遺傳分析的信息最為豐富， 可以估計(jì)可以估計(jì)加性加性效應(yīng)和效應(yīng)和顯性顯性效應(yīng)，效應(yīng)， 但是但是 F2 提供的種子有限，很難進(jìn)行連續(xù)性研究。提供的種子有限，很難進(jìn)行連續(xù)性研究。 （2）回交（）回交（BC）群體）群體陳冰嬬，石英堯，崔金騰，等陳冰嬬，石英堯，崔金騰，等. 利用利用BC2F2高代回交

10、群體定位水稻籽粒大小高代回交群體定位水稻籽粒大小和形狀和形狀QTL. 作物學(xué)報(bào)，作物學(xué)報(bào)，2008, 34(8): 12991307 暫時(shí)性群體暫時(shí)性群體（3）重組自交系群體（）重組自交系群體（RIL）；）； 經(jīng)過連續(xù)多代經(jīng)過連續(xù)多代自交自交或或姊妹交姊妹交產(chǎn)生的，這使得染色體間重組機(jī)會(huì)增加，產(chǎn)生的，這使得染色體間重組機(jī)會(huì)增加，因而可以用來因而可以用來更精確地定位那些緊密連鎖的位點(diǎn)更精確地定位那些緊密連鎖的位點(diǎn)； 另外它可以連續(xù)提供家系內(nèi)遺傳上一致的種子，另外它可以連續(xù)提供家系內(nèi)遺傳上一致的種子， 因此可以進(jìn)行因此可以進(jìn)行重復(fù)區(qū)組試驗(yàn)重復(fù)區(qū)組試驗(yàn)，把區(qū)組效應(yīng)、重復(fù)效應(yīng)和隨機(jī)誤差最小，把區(qū)組效應(yīng)

11、、重復(fù)效應(yīng)和隨機(jī)誤差最小化或分解開來，檢測化或分解開來，檢測 QTL 的準(zhǔn)確性的準(zhǔn)確性增加。增加。 但是構(gòu)建這樣的群體需要但是構(gòu)建這樣的群體需要很長時(shí)間很長時(shí)間，而且不能估計(jì)顯性效應(yīng)。，而且不能估計(jì)顯性效應(yīng)。 （4）DH群體（雙單倍體群體）群體（雙單倍體群體） 。 F1雜種水稻植株雜種水稻植株，取花藥，培養(yǎng)再生植株，秋水仙素處理，移栽，開，取花藥，培養(yǎng)再生植株，秋水仙素處理，移栽，開花期套袋自交，單株收獲種子?；ㄆ谔状越唬瑔沃晔斋@種子。 永久性永久性群體群體 近等基因系近等基因系 以上群體在以上群體在 QTL 定位方面存在共同局限性，定位方面存在共同局限性， 即對(duì)即對(duì) QTL 的精確定位能力

12、不強(qiáng)，的精確定位能力不強(qiáng)， 如果要如果要精細(xì)定位精細(xì)定位 QTL ，那么最好的研究群體是，那么最好的研究群體是近等基因系近等基因系。 近等基因系基本特征是整個(gè)染色體的絕大部分區(qū)間完全相同，近等基因系基本特征是整個(gè)染色體的絕大部分區(qū)間完全相同， 只在一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)區(qū)間彼此存在差異，只在一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)區(qū)間彼此存在差異， 因此它能使整個(gè)基因組間的多個(gè)因此它能使整個(gè)基因組間的多個(gè) QTLs 分解分解為只存在一個(gè)或幾個(gè)為只存在一個(gè)或幾個(gè) QTLs 分離，分離， 消除其它背景干擾消除其它背景干擾 消除主效消除主效 QTL 對(duì)微效對(duì)微效 QTL 效應(yīng)的掩蓋作用，效應(yīng)的掩蓋作用， 對(duì)對(duì) QTL 精細(xì)定位很有幫

13、助。精細(xì)定位很有幫助。5. 植物基因克隆篩選植物基因克隆篩選把已知的把已知的轉(zhuǎn)座基因轉(zhuǎn)座基因轉(zhuǎn)化異源植物，轉(zhuǎn)化異源植物，通過轉(zhuǎn)座因子標(biāo)簽法通過轉(zhuǎn)座因子標(biāo)簽法定向誘導(dǎo)定向誘導(dǎo)突變體，突變體，已成為克隆植物基因的有效途徑之一。已成為克隆植物基因的有效途徑之一。關(guān)鍵：關(guān)鍵：篩選篩選到轉(zhuǎn)座因子引起的到轉(zhuǎn)座因子引起的表型突變體表型突變體。單倍體單倍體可直接表達(dá)隱性基因的性狀，可直接表達(dá)隱性基因的性狀，更適合在更適合在細(xì)胞水平篩選細(xì)胞水平篩選突變體。突變體。l花粉小孢子發(fā)育途徑花粉小孢子發(fā)育途徑正常正常發(fā)育途徑：形成發(fā)育途徑：形成花粉花粉。離體發(fā)育離體發(fā)育途徑途徑花粉花粉孢子體發(fā)育孢子體發(fā)育途徑：途徑：花

14、粉或小孢子沿孢子體發(fā)育途徑發(fā)育成花粉或小孢子沿孢子體發(fā)育途徑發(fā)育成花粉植株花粉植株的過程稱為雄核發(fā)育。的過程稱為雄核發(fā)育。小孢子小孢子營養(yǎng)核營養(yǎng)核生殖核生殖核營養(yǎng)核退化營養(yǎng)核退化生殖核退化生殖核退化共同分裂共同分裂復(fù)制后復(fù)制后核融合核融合C2個(gè)相似營養(yǎng)核個(gè)相似營養(yǎng)核重復(fù)分裂重復(fù)分裂核融合核融合后重復(fù)分裂后重復(fù)分裂單倍體胚單倍體胚2倍體胚倍體胚3倍體胚倍體胚4倍體胚倍體胚單倍體胚單倍體胚多倍體胚多倍體胚不均等分裂不均等分裂均等分裂均等分裂AB花粉離體培養(yǎng)的發(fā)育花粉離體培養(yǎng)的發(fā)育 單核小孢子第一次有絲分裂單核小孢子第一次有絲分裂 A途徑途徑（單倍體）（單倍體） 花粉進(jìn)行花粉進(jìn)行不對(duì)稱分裂不對(duì)稱分裂

15、，形成一個(gè)大的，形成一個(gè)大的營養(yǎng)營養(yǎng)細(xì)胞和小的細(xì)胞和小的生殖生殖細(xì)胞，細(xì)胞，接著分裂形成接著分裂形成胚胚或或愈傷組織愈傷組織。 B途徑途徑（單或多倍體）（單或多倍體） 花粉進(jìn)行花粉進(jìn)行對(duì)稱分裂對(duì)稱分裂，細(xì)胞相似于，細(xì)胞相似于營養(yǎng)營養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞，發(fā)育成發(fā)育成胚狀體胚狀體或或愈傷組織愈傷組織。 C途徑途徑（非單倍體）（非單倍體） 生殖細(xì)胞與營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞與營養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)發(fā)育同時(shí)發(fā)育，核融合核融合形成形成胚狀體胚狀體。一、花藥培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)1. 材料的選取材料的選取關(guān)鍵在于選取處于合適關(guān)鍵在于選取處于合適發(fā)育期發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，

16、從實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂減數(shù)分裂至至雙核期雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體雄核發(fā)育。的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體雄核發(fā)育?；ǚ鄣陌l(fā)育時(shí)期：花粉的發(fā)育時(shí)期： 四分體四分體 小孢子小孢子 單核花粉單核花粉 雙核花粉雙核花粉 最適期最適期（單核晚期（單核晚期-雙核晚期）雙核晚期） 第二節(jié)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)方法花藥和花粉培養(yǎng)方法*預(yù)處理，增加綠苗產(chǎn)量。預(yù)處理，增加綠苗產(chǎn)量。 （1）高、低溫處理）高、低溫處理常用的預(yù)處理方法是常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏低溫冷藏，具體的處理溫度和時(shí)間長短因植物種類而異。具體的處理溫度和時(shí)間長短因植物種類而異。 水稻：水稻：5-10，3-12d； 35， 15min。 小麥：小

17、麥：1-5，2-7d； 35 ， 8d2. 材料預(yù)處理材料預(yù)處理低溫處理的低溫處理的作用作用1）可以激發(fā)花粉母細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)相等核，）可以激發(fā)花粉母細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)相等核， 而不是一個(gè)營養(yǎng)核一個(gè)生殖核；而不是一個(gè)營養(yǎng)核一個(gè)生殖核；2）保持高比例的強(qiáng)生活力花粉，）保持高比例的強(qiáng)生活力花粉， 同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老；同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老；3）激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；）激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；4）促使細(xì)胞同步分裂。）促使細(xì)胞同步分裂。（2）化學(xué)物質(zhì)處理）化學(xué)物質(zhì)處理高糖：高糖預(yù)處理提高愈傷組織和胚狀體的高糖：高糖預(yù)處理提高愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)率誘導(dǎo)率。 提高愈傷誘導(dǎo)：玉米，提高愈傷誘導(dǎo)：玉米，25%蔗糖蔗糖，

18、6-8min。 甘露醇：處理造成小孢子甘露醇：處理造成小孢子饑餓饑餓，引起，引起脫分化脫分化。 秋水仙素：導(dǎo)致秋水仙素：導(dǎo)致均等分裂均等分裂。 乙烯利：誘導(dǎo)額外分裂，使乙烯利：誘導(dǎo)額外分裂，使多核花粉多核花粉增多。增多。（3）其他）其他 射線：誘導(dǎo)射線：誘導(dǎo)愈傷愈傷組織形成。組織形成。 離心：離心：重力重力作用影響小孢子發(fā)育，提高作用影響小孢子發(fā)育，提高單倍體單倍體植株誘導(dǎo)率。植株誘導(dǎo)率。 磁場：提高磁場：提高愈傷組織愈傷組織誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率。 3. 消毒消毒3-5低溫處理低溫處理3-10天天-（大花蕾將（大花蕾將萼片萼片剝掉）剝掉）-70%酒精幾秒酒精幾秒-0.1%升汞升汞10min-無菌水沖

19、洗。無菌水沖洗。4. 接種與培養(yǎng)接種與培養(yǎng) 鑷子剝?nèi)セò觇囎觿內(nèi)セò?- 花藥花藥均勻接種于培養(yǎng)基上，均勻接種于培養(yǎng)基上， 常用培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基MS、N6和馬鈴薯培養(yǎng)基。和馬鈴薯培養(yǎng)基。 蔗糖蔗糖5-10%， 可可固體固體培養(yǎng)或培養(yǎng)或液體液體培養(yǎng)。培養(yǎng)。 20-30， 光照光照12h。5. 花藥培養(yǎng)下花粉的發(fā)育花藥培養(yǎng)下花粉的發(fā)育（1）愈傷組織）愈傷組織-植株植株禾本科禾本科植物通常不能形成胚狀體。植物通常不能形成胚狀體。培養(yǎng)基中含培養(yǎng)基中含2,4-D（1-2mg/L)，花粉粒誘導(dǎo)，花粉粒誘導(dǎo)愈傷組織愈傷組織；愈傷組織生長愈傷組織生長10-15天，直徑天，直徑1.5-2.0mm時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)入器官轉(zhuǎn)入

20、器官分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基（不含（不含2，4-D ，含，含NAA和和KT各各0.5mg/L），），分化根、芽。分化根、芽。 （降低降低生長素與蔗糖濃度，生長素與蔗糖濃度，提高提高細(xì)胞分裂素）細(xì)胞分裂素）倍性混亂倍性混亂（2）胚狀體）胚狀體-植株植株 煙草煙草花藥在花藥在無激素培養(yǎng)基無激素培養(yǎng)基上，上， 3周后在花藥在花藥開裂處可見許多淡黃色周后在花藥在花藥開裂處可見許多淡黃色胚狀體胚狀體， 見光后轉(zhuǎn)綠，見光后轉(zhuǎn)綠， 逐步長成小苗。逐步長成小苗。 單核期或單核中晚期。單核期或單核中晚期。 多為單倍體。多為單倍體。 6. 壯苗和移栽壯苗和移栽小麥小麥（王培等）（王培等）2-3片葉轉(zhuǎn)入片葉轉(zhuǎn)入MS +

21、多效唑多效唑3mg/L+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L +水解乳蛋白水解乳蛋白LH500mg/L+蔗糖蔗糖8%22-25 壯苗壯苗然后然后3-8 低溫弱光低溫弱光越夏越夏深秋煉苗深秋煉苗移栽移栽。7. 單倍體植株的加倍單倍體植株的加倍人工加倍，秋水仙素人工加倍，秋水仙素0.02-0.4%草莓花藥愈傷組織草莓花藥愈傷組織草莓花藥再生植株草莓花藥再生植株花粉培養(yǎng)比花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)比花藥培養(yǎng)優(yōu)越優(yōu)越：從較少的花藥得到從較少的花藥得到大量大量的花粉植株；的花粉植株；不存在體細(xì)胞干擾不存在體細(xì)胞干擾；沒有混倍沒有混倍現(xiàn)象，便于生理生化研究?，F(xiàn)象，便于生理生化研究。二、花粉培養(yǎng)二、花粉培養(yǎng)一）花

22、藥預(yù)培養(yǎng)一）花藥預(yù)培養(yǎng)適合的花蕾適合的花蕾-有濾紙的培養(yǎng)皿中有濾紙的培養(yǎng)皿中-5幾天幾天-滅菌滅菌-取出花藥取出花藥-接種于培養(yǎng)基中數(shù)天接種于培養(yǎng)基中數(shù)天-將花粉分離將花粉分離-懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)。 1 1取材時(shí)期的確定取材時(shí)期的確定四分體四分體單核早期單核早期單核單核晚期晚期雙核早期雙核早期雙核晚期雙核晚期三核期三核期 小小 孢孢 子子 花花 粉粉 粒粒 花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng) 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)大多數(shù)園藝植物的大多數(shù)園藝植物的花藥花藥培養(yǎng)，培養(yǎng)，成功率最高的是成功率最高的是單核單核期或期或單核單核中晚期。中晚期。（二）花粉培養(yǎng)（二）花粉培養(yǎng)適合的花蕾適合的花蕾- -消毒消毒- -取出花藥取出花藥-

23、 -燒杯壁中擠壓花藥燒杯壁中擠壓花藥- -尼龍網(wǎng)過濾尼龍網(wǎng)過濾- -花粉花粉液離心液離心- -花粉粒沉淀花粉粒沉淀- -培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)基稀釋- -純凈花粉群體純凈花粉群體。 （1）自然散落法）自然散落法 （2）擠壓法）擠壓法 取出花藥，放在加有液體培養(yǎng)基的小燒杯中，用粗的玻棒，取出花藥，放在加有液體培養(yǎng)基的小燒杯中，用粗的玻棒， 在燒杯壁上擠壓花藥室，使花粉從花藥中釋放出來在燒杯壁上擠壓花藥室，使花粉從花藥中釋放出來. （3）機(jī)械游離）機(jī)械游離 磁攪拌法磁攪拌法 小型攪拌（超速旋切）法小型攪拌（超速旋切）法2. 花粉的分離與純化花粉的分離與純化（4 4）小孢子分離和純化）小孢子分離和純化 根據(jù)

24、不同植物花粉粒的大小，根據(jù)不同植物花粉粒的大小， 選用孔徑大小合適的選用孔徑大小合適的尼龍網(wǎng)尼龍網(wǎng)（孔徑（孔徑20-60m）過濾，）過濾， 除去藥壁組織除去藥壁組織. 過濾后的花粉液在過濾后的花粉液在低速離心低速離心（100-160轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分）分）3min， 使花粉粒沉于離心管使花粉粒沉于離心管下部下部， 再用新鮮再用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)基稀釋，重復(fù)兩次，稀釋，重復(fù)兩次， 可得到純凈的花粉群體可得到純凈的花粉群體.（1）平板培養(yǎng)（）平板培養(yǎng)（plate cultivation method） 花粉置花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基瓊脂固化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體胚狀體， 進(jìn)而分化成植株

25、。進(jìn)而分化成植株。（2）液體培養(yǎng)）液體培養(yǎng) 易造成易造成通氣不良通氣不良。（3）固體）固體-液體液體雙層雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基在上層上層。（4）看護(hù)看護(hù)培養(yǎng)（培養(yǎng)（nurse cultivation method） 將完整的將完整的花藥花藥或花藥的或花藥的愈傷組織愈傷組織放在瓊脂培養(yǎng)基上，放在瓊脂培養(yǎng)基上， 將將圓片濾紙圓片濾紙放在花藥或花藥愈傷組織上，放在花藥或花藥愈傷組織上， 然后將然后將花粉花粉置于濾紙的上方。置于濾紙的上方。3. 花粉培養(yǎng)方法花粉培養(yǎng)方法（5 ）微室培養(yǎng)）微室培養(yǎng)（microchamber culture method） 大、小玻璃片做成大、小

26、玻璃片做成微室微室，倒懸培養(yǎng)。，倒懸培養(yǎng)。（6 ）條件條件培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng) (conditioned medium method) 預(yù)先培養(yǎng)了花藥的培養(yǎng)基預(yù)先培養(yǎng)了花藥的培養(yǎng)基（含有花藥提取物）上培養(yǎng)花粉，（含有花藥提取物）上培養(yǎng)花粉， 可促進(jìn)花粉發(fā)育，有利于花粉培養(yǎng)成功?？纱龠M(jìn)花粉發(fā)育，有利于花粉培養(yǎng)成功。1. 基因型基因型 植物基因型是影響離體誘導(dǎo)單倍體成功的植物基因型是影響離體誘導(dǎo)單倍體成功的最重要最重要的因素的因素之一之一。 水稻：糯水稻：糯粳粳粳粳/秈秈秈秈秈秈/秈，糯稻花粉愈傷組織誘導(dǎo)率秈，糯稻花粉愈傷組織誘導(dǎo)率10%。 裸子植物裸子植物較難。較難。2. 植物生長條件和生理狀態(tài)

27、植物生長條件和生理狀態(tài) 植株的生長條件（如光周期、光強(qiáng)、溫度和礦質(zhì)營養(yǎng)）和生理狀態(tài)植株的生長條件（如光周期、光強(qiáng)、溫度和礦質(zhì)營養(yǎng)）和生理狀態(tài) 是影響雄核發(fā)育的又一重要因素。是影響雄核發(fā)育的又一重要因素。 一般來說，一般來說， 取相對(duì)取相對(duì)年幼年幼植株上植株上開花始期開花始期的花比開花末期的花更適當(dāng)，的花比開花末期的花更適當(dāng)， 開花開花早期早期較好。較好。三、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素三、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素*3. 花粉發(fā)育時(shí)期花粉發(fā)育時(shí)期 花藥接種前一般需要先用醋酸洋紅染色壓片花藥接種前一般需要先用醋酸洋紅染色壓片鏡檢鏡檢， 以確定花粉的發(fā)育時(shí)期。以確定花粉的發(fā)育時(shí)期。 不同

28、植物不同植物差別較大差別較大。4. 藥壁因子藥壁因子 許多研究表明，許多研究表明， 在花粉胚發(fā)育過程中在花粉胚發(fā)育過程中花藥壁花藥壁起著起著重要作用。重要作用。 藥壁看護(hù)培養(yǎng)藥壁看護(hù)培養(yǎng)5. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基（1）基本培養(yǎng)基）基本培養(yǎng)基 禾谷類作物禾谷類作物-朱至清朱至清N6； 煙草煙草-H； 小麥小麥-王培王培C17、歐陽文俊、歐陽文俊W14等。等。 高濃度的高濃度的銨離子銨離子抑制花粉愈傷組織形成。抑制花粉愈傷組織形成。（2）碳源）碳源 蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等都曾用于不同植物的試驗(yàn)，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等都曾用于不同植物的試驗(yàn)， 葡萄糖葡萄糖提高提高小麥小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率?；ǚ叟叩恼T導(dǎo)頻率。

29、 蔗糖蔗糖濃度濃度 單子葉（水稻單子葉（水稻3-6%，小麥，小麥6-10%，玉米，玉米12-15%）雙子葉（雙子葉（3%）（3）氨基酸和其他有機(jī)物質(zhì)）氨基酸和其他有機(jī)物質(zhì) 天然有機(jī)附加物可天然有機(jī)附加物可提高提高花粉愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)率，花粉愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)率，促進(jìn)促進(jìn)生長。生長。 （4）植物激素）植物激素 不同植物對(duì)種類和量的需求不同，不同植物對(duì)種類和量的需求不同， 生長素生長素促愈傷組織形成，促愈傷組織形成， 2，4-D誘導(dǎo)愈傷，但抑制誘導(dǎo)愈傷，但抑制愈傷組織愈傷組織分化分化成胚狀體。成胚狀體。（5）活性炭（）活性炭（0.5%） 較強(qiáng)的吸附作用，較強(qiáng)的吸附作用，促進(jìn)促進(jìn)花粉分裂。花粉

30、分裂。（6）pH 曼陀羅曼陀羅5.8；油菜；油菜6.2； 小麥，誘導(dǎo)愈傷小麥，誘導(dǎo)愈傷5.6，綠苗分化，綠苗分化6.1。 溫度：比愈傷要求溫度：比愈傷要求更高更高； 光照：光照：紅光紅光有利；有利； 小孢子植板小孢子植板密度密度：影響很大：影響很大6. 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件第三節(jié)第三節(jié) 單倍體植株的染色體加倍單倍體植株的染色體加倍一、花粉和花藥植株的倍性鑒定一、花粉和花藥植株的倍性鑒定1.染色體染色體直接直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法 根尖或莖尖。根尖或莖尖。2.間接鑒定間接鑒定（1）掃描細(xì)胞光度儀鑒定）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（又稱（又稱流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 flow cytometry，F(xiàn)CM） DNA含量含量（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 葉片葉片保衛(wèi)細(xì)胞保衛(wèi)細(xì)胞的大小、單位面積上的的大小、單位面積上的氣孔氣孔數(shù)、數(shù)、 保衛(wèi)細(xì)胞