1、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)課程論文學(xué) 院： 農(nóng)學(xué)院 班 級：種子科學(xué)與工程（1）班姓 名： 董帥廳 學(xué) 號：201241531108課程論文題目：轉(zhuǎn)基因工程在小麥上的應(yīng)用綜述課程名稱：種子學(xué)評閱成績：評閱意見：成績評定教師簽名：日期： 年 月 日轉(zhuǎn)基因工程在小麥上的應(yīng)用綜述摘要：小麥是世界上主要的糧食作物，自1992年第一株轉(zhuǎn)基因小麥誕生以來，小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展較快，為開展小麥分子育種奠定了基礎(chǔ)。目前，研究涉及抗病、抗蟲、抗逆、品質(zhì)改良、提高產(chǎn)量等方面，其中研究較多的為抗病(39.7%)和品質(zhì)改良(25.6%)，部分轉(zhuǎn)基因小麥品系已進行環(huán)境釋放及生產(chǎn)性試驗 1 。 關(guān)鍵詞： 小麥 幼胚培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因1 小麥幼

2、胚組織培養(yǎng)品種及幼胚胚齡的選擇1.1 小麥幼胚組織培養(yǎng)品種選擇 自1978年Shimada成功地通過小麥幼胚培養(yǎng)獲得再生植株以來，幼胚被認為是小麥組織培養(yǎng)最有效、最理想的外植體來源之一。Xia等在用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥胚性愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，成功的基因轉(zhuǎn)化依賴于適宜基因型的選擇，并且小麥幼胚培養(yǎng)效率與小麥品種、栽培地區(qū)有關(guān)。故大多數(shù)研究者都是從本地出發(fā)，以本地選育的小麥品種、品系以及農(nóng)家品種為測試對象，考察幼胚脫分化和再生植株特性。這些品種主要集中在安徽、河北、河南、陜西、江蘇、山東、四 川、黑龍江、湖北、山西、北京等主要小麥種植區(qū)域2。1.2 小麥幼胚組織培養(yǎng)幼胚胚齡的選擇胚齡對幼胚組織培養(yǎng)的影響

3、。不同胚齡對小麥幼胚組織培養(yǎng)的作用效果明顯不同, 其結(jié)果記錄于表 1。 由表 1 可知, 幼胚在 10 20 d 胚齡時均能較好地形成愈傷組織,其出愈率皆在 90. 00%以上;其中, 12 d 、14 d、16 d 胚 齡時形成愈傷組織塊最多,其出愈率分別為 95. 00%、95. 00%、 96. 67%;幼胚在 14 d 和 16 d 胚齡時胚性愈傷組織形成顯著地 高于其他胚齡,其胚性誘導(dǎo)率分別為 54. 39%、60. 34%。因此, 胚齡對幼胚組織培養(yǎng)出愈率影響不大,適宜范圍為 12 16d; 胚性愈傷組織誘導(dǎo)的適宜胚齡為 14 16 d;綜合考慮胚齡對出愈率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的作

4、用, 幼胚組織培養(yǎng)適宜的胚齡為 14 16d3 。在小麥幼胚培養(yǎng)中，衡量小麥最適胚齡的標準因研究方向和思維各異。目前主要通過長度，直徑，授粉后發(fā)育時間，種子形態(tài)指標等來進行判斷2。 1.3 小麥幼胚組織培養(yǎng)幼胚基因型的選擇 在小麥幼胚培養(yǎng)中不同的基因型在致密愈傷組織的誘導(dǎo)頻率、分化頻率及分化能力的保持方面存在一定的差異。在地域性上美國冬小麥出愈率高于中國半冬性小麥，在無性系株系與常規(guī)材料之間，前者高于后者，在歷代雜交種與雙親間的出愈關(guān)系上不同組合中出現(xiàn)較大差異,并且存在明顯的劑量性4 。與之相反，蔡體樹等對F0和F1代未成熟胚進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其愈傷組織的分化能力都沒有表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，無論是接種的

5、外植體本身處于雜合狀態(tài)，還是供體植株處于雜合狀態(tài)，愈傷組織的分化能力都不存在雜種優(yōu)勢現(xiàn)象。品種之間對離體培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，究竟受不受遺傳特性的影響，人們對小麥組織培養(yǎng)力（Tissue couture Respone，TCR）進行染色體水平和基因水平的 研究表明，小麥幼胚培養(yǎng)力是受少數(shù)基因控制的質(zhì)量性狀，同時也存在一些修飾基因，許多控制幼胚培養(yǎng)力的基因位于染色體B上，且第2、 4、 6部分同源染色體群對幼胚培養(yǎng)力的影響較大。小麥幼胚培養(yǎng)力也與細 胞質(zhì)因子有關(guān)，特定的核質(zhì)組合與培養(yǎng)條件的互作與幼胚培養(yǎng)力有密切的關(guān)系5。2 小麥轉(zhuǎn)基因方法 2.1 PEG法與電激法 在小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究早期階段，轉(zhuǎn)化

6、多以原生質(zhì)體為受體進行，依賴于小麥原生質(zhì)體的植株再生。原生質(zhì)體再生植株最早是在20世紀70年代在煙草中獲得的，后來這項技術(shù)逐漸擴展應(yīng)用于禾谷類作物。聚乙二醇誘導(dǎo)的小麥原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化，是通過多聚分子PEG在二價陽離子的作用下與裸露的DNA 形成共沉淀，誘導(dǎo)外源DNA進入原生質(zhì)體，進行遺傳轉(zhuǎn)化。郭光沁等用分別帶有 G U S 和 H P T 的pBI221 及pBI222作為載體，轉(zhuǎn)化小麥品種濟南177的原生質(zhì)體，篩選得到抗性體細胞胚和小塊愈傷組織，進而獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化頻率達2×10-53×10-5。 電激介導(dǎo)的小麥原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化，是由PEG直接導(dǎo)入法發(fā)展而來的。電激介

7、導(dǎo)轉(zhuǎn)化借助高強度電脈沖作用，使原生體質(zhì)膜產(chǎn)生瞬時可逆穿孔，導(dǎo)致DNA分子穿過小孔進入原生質(zhì)體。梁輝等用改良的環(huán)形電極，將 B a r 和 G U S 導(dǎo)入完整的小麥幼胚組織中，經(jīng) PCR和Southern雜交分析，外源基因已穩(wěn)定整合到小麥基因組中，轉(zhuǎn)化頻率達7.5%。雖然已經(jīng)用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植 株，但該法在小麥中的應(yīng)用至今還不夠理想。原因是 此方法需要以原生質(zhì)體培養(yǎng)為基礎(chǔ)，而小麥原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)難度大、周期長，培養(yǎng)過程中體細胞突變率高，再生植株能力低，即使獲得再生植株，也往往不育。且獲得的轉(zhuǎn)基因植株普遍存在著結(jié)實率低，外源DNA拷貝數(shù)高、片段化、基因重排以及基因表達沉默等問題

8、6 。 2.2 離子束介導(dǎo)法 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是在低能離子束注入植物組織后，對植物細胞產(chǎn)生刻蝕，受刻蝕后的細胞壁產(chǎn)生局部穿孔，細胞膜透性發(fā)生變化，從而可為外源DNA進入細胞提供多個可自動修復(fù)的微通道。另外，帶正電的離子在微通道內(nèi)積累，有助于帶負電的外源DNA進入細胞。同時，離子注入對靶細胞DNA造成一定損傷，由損傷誘導(dǎo)的修復(fù)作用可為外源DNA在受體基因 組上的整合和重組提供便利條件。2.3 花粉管通道法 花粉管通道法是80年代初期根據(jù)植物遠緣雜交理論提出的外源基因?qū)敕椒? 即利用植物授粉后在子房中形成的花粉管(花粉引導(dǎo)組織), 外源質(zhì)粒DNA經(jīng)花粉管和珠心進入胚囊, 進一步進入受精卵, 由于剛

9、剛完成受精的卵細胞還處于類似原生質(zhì)體狀態(tài), 尚未形成細胞壁, 正在活躍的進行 DNA 復(fù)制和細胞分裂, 可以將外源DNA片段整合到受體基因組中。Langridge 等嘗試了花粉管通道法, 但沒 有獲得轉(zhuǎn)基因植株。曾君祉等利用花粉管通道法 將 nptII 基因?qū)肓诵←? 獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株。成卓敏等利用花粉管通道法將大麥黃矮病毒 CP 基因?qū)肓诵←? 培育了抗黃矮病轉(zhuǎn)基因小麥新材料。后 來, 我國學(xué)者對花粉管通道法在小麥中的應(yīng)用進行了 更多探索和應(yīng)用7 。2.4 基因槍法 基因槍轟擊是將外源基因在Ca2+或亞精胺等作用下吸附在重金屬金或鎢粒子表面（直徑1 mm左右）制成DNA微彈，用基因槍

10、將微彈高速射入植物受體細胞，釋放出的DNA分子隨機整合到植物基因組中，從而實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。自Vasil等在世界上首次報道利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株至今，由基因槍介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化作為改良小麥性狀、提高小麥抗性的主要手段之一被廣為應(yīng)用。王小軍等用基因槍將含有 CaMV35S啟動子的 B x n 基因和 N P T I I 基因?qū)胄←溣着吆?，以抗性鑒定和Southern雜交分析證明，獲得的 是轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化頻率為1.9%。在隨后的幾年中，人們又相繼以小麥的幼胚、幼穗、盾片以及來源于它們的胚性愈傷組織等為靶組織，用基因槍將具有抗逆、抗病、抗蟲、抗除草劑、優(yōu)質(zhì) 8 等性狀的目的基因?qū)胄←?/p>

11、，由此小麥基因工程研究進入了一個新的階段。 2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 在植物基因工程的發(fā)展中，研究和應(yīng)用比較清楚和成功的是根癌農(nóng)桿菌( A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s )介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。根癌農(nóng)桿菌攜帶的Ti質(zhì)粒上含有一段可以轉(zhuǎn)入植物細胞中的T-DNA(Transfer DNA)，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的基本原理亦即構(gòu)建到T-DNA上的目標基因可隨T-DNA導(dǎo)入植物，進而整合到受體植物的染色體上。過去人們一直認為包括小麥在內(nèi)的禾谷類作物不在農(nóng)桿菌的宿主范圍之內(nèi)，直到20世紀90年代，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)才在單子葉植物上取得了突破性的進展。在小

12、麥上，Mooney等用掃描電鏡觀察證明了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的可行性，但未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。1997年，Cheng等首次報告利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了較高頻率穩(wěn)定結(jié)合的小麥轉(zhuǎn)基因植株并對后代進行了分析。隨后，一些學(xué)者也相繼報告了農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的成功6。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化成功的受體類型主要是以幼胚、幼穗、成熟胚和花藥為外植體的離體組織和以莖尖 生長點和花器官為受體的整株水平轉(zhuǎn)化。由于幼胚 具有高的再生率，目前報道的大多數(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化以幼胚為受體材料4，但是由于這些離體組織 依賴于組織培養(yǎng)和植株再生途徑，操作復(fù)雜、耗時、成本高、轉(zhuǎn)化效率低、容易產(chǎn)生體細胞變異和高的基因型依賴，并且易發(fā)生

13、農(nóng)桿菌的二次污染，對操作和培養(yǎng)條 件要求也極其嚴格。因此，不依賴于組織培養(yǎng)的小麥整株水平轉(zhuǎn)化近年來吸引了人們的更大興趣。 3 展望利用基因工程方法育種有其獨特的優(yōu)勢，不僅基因來源廣泛而且能夠?qū)崿F(xiàn)對特定性狀精確高效的改良，有著廣闊的應(yīng)用前景。在小麥轉(zhuǎn)基因育種方面，雖然已成功獲得一批轉(zhuǎn)基因小麥植株，但與其他作物相比，通過轉(zhuǎn)基因方法育種仍存在較大差距。完善的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系尚未建立，小麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)還不能作為一項常規(guī)技術(shù)普遍應(yīng)用。目前在小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)上主要還是依賴基因槍法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相對于基因槍法成本較低，但利用離體組織受體的方法依然較為費時、費力，而且對當前生產(chǎn)上主栽品種某一性狀的改良，往往經(jīng)

14、過組織培養(yǎng)和再生階段后其生產(chǎn)力明顯 下降。利用小麥幼穗活體水平上的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有其他方法所不可比擬的優(yōu)勢，成本低、操作簡便，轉(zhuǎn)化 效率高，而且當代可獲得轉(zhuǎn)基因的種子，T2代可獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系，無需組培再生階段，對于保持主栽品 種的生產(chǎn)力而改善其某一性狀具有特殊的優(yōu)勢，有望發(fā)展為小麥轉(zhuǎn)基因的常規(guī)技術(shù)，在提高小麥的品質(zhì)性狀和抗逆性能等方面的品種改良中發(fā)揮重要作用9。1 小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用_喻修道2 小麥幼胚組織培養(yǎng)研究進展_左靜靜3 胚齡和激素對小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響_趙占軍.4 梁竹青,高明尉.不同小麥基因型對體細胞組織培養(yǎng)的反應(yīng)J.Z中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1986,(2):42-48.5 徐星明,于飛.小麥幼胚組織培養(yǎng)力的遺傳研究J.遺傳,1991,13 (6):34-37.。6 小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)化功能基因研究進展_王維7 小麥轉(zhuǎn)基因方法及其評述_葉興國8 Chen