1、G6PD的臨床生物化學(xué)檢測中國中國南寧南寧 黃崇庭黃崇庭 2022-6-16目目 錄錄一、一、G6PD與與G6PD缺乏癥缺乏癥二、二、G6PD的發(fā)病機(jī)制的發(fā)病機(jī)制三、三、G6PD的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律四、四、G6PD臨床生物化學(xué)檢測臨床生物化學(xué)檢測五、華南常見五、華南常見G6PD試劑盒的概況試劑盒的概況 六、美康六、美康G6PD調(diào)試經(jīng)驗(yàn)調(diào)試經(jīng)驗(yàn)七、案例分享七、案例分享一、一、G6PD與與G6PD缺乏癥缺乏癥1、什么是、什么是G6PD？ G6PD是葡萄糖葡萄糖6磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶的簡稱，是一種存在于人體紅細(xì)胞內(nèi)，協(xié)助葡萄糖進(jìn)行新陳代謝的一種重要的酶類，在這代謝過程中會(huì)產(chǎn)生NA

2、DPH（還原型輔酶）的物質(zhì)能以保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化物質(zhì)的威脅。 G6PD缺乏時(shí)，若身體接觸到具氧化性的特定物質(zhì)或服用了這類藥物，紅血球就容易被破壞而發(fā)生急性溶血反應(yīng)。G6PD 對(duì)于磷酸戊糖旁路至關(guān)重要，而該途徑可為髓鞘脂酸形成提供 NADPH 。2、什么是什么是G6PD缺乏癥？缺乏癥？ G6PD缺乏癥缺乏癥是由G6PD基因突變，導(dǎo)致該酶活性降低，紅細(xì)胞因?yàn)槿狈ADPH而不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，引起溶血性貧血的一種遺傳病。常因食用蠶豆而發(fā)病，俗稱“蠶豆病”。二、二、G6PD的發(fā)病機(jī)制的發(fā)病機(jī)制葡萄糖的代謝途徑，主要是糖酵解進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生ATP，次要途徑是磷酸戊糖途經(jīng)，產(chǎn)生NADPH和磷

3、酸核糖。二、二、G6PD的發(fā)病機(jī)制的發(fā)病機(jī)制磷酸戊糖途經(jīng)磷酸戊糖途經(jīng)G6PDG6P 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂+NADPHG6PD谷胱甘肽還原型+氧化性物質(zhì) 谷胱甘肽氧化型 NADPH在紅細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽還原型可以抵抗氧化性的物質(zhì)，在維持紅細(xì)胞的細(xì)胞膜穩(wěn)定方面起到重要作用，如果G6PD缺乏導(dǎo)致NADPH不足，谷胱甘肽的作用降低，從而使紅細(xì)胞模受損，在一定條件下容易產(chǎn)生紅細(xì)溶血，引起一些不良癥狀。三、三、G6PD的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律1、G6PD流行病學(xué)流行病學(xué) 據(jù)估計(jì), 全球約有4億人受累, 我國華南及西南各省較常見, 主要分布在熱帶和亞熱帶, 我國的南方地區(qū)是高發(fā)區(qū),尤其是廣西、

4、廣東、云南、福建等省, 北方地區(qū)較少見。我國各地發(fā)生率報(bào)道不一,上海為0.78%、長沙0.90%、南昌為1.20%、南寧南寧為7.20%、昆明為2.50%。此病廣東地區(qū)平均發(fā)病率為5% 10%, 廣州市為3.70%、東莞3.20%、深圳2.30%, 中山發(fā)生率4.20%。2、G6PD的遺傳規(guī)律的遺傳規(guī)律G6PD缺乏程度與性別的關(guān)系，G6PD缺乏是伴伴X不完全顯性遺傳不完全顯性遺傳,基因位于X染色體上。 缺失：缺失： 男性只有一條X染色體, 一旦這唯一的染色體缺失G6PD基因, 則表現(xiàn)為G6PD重度缺乏, 而女性有兩條X染色體, 如果僅有1條X染色體缺失G6PD基因, 則為雜合子, 表現(xiàn)為中度缺

5、乏, 只有兩條X染色體均缺G6PD基因才表現(xiàn)為重度缺乏。 基因突變：基因突變：不同的基因突變類型，可以導(dǎo)致G6PD結(jié)構(gòu)不一樣，酶活性有差異，即使G6PD基因沒有缺失，也有可能存在不同程度缺乏。四、四、G6PD臨床生物化學(xué)檢測臨床生物化學(xué)檢測1、G6PD檢測的臨床意義檢測的臨床意義紅細(xì)胞G6PD 催化反應(yīng)生成的NADPH 是谷胱甘肽還原酶的輔酶，還原型谷胱甘肽(GSH) 是保持血紅蛋白穩(wěn)定性及紅細(xì)胞膜完整性的必要條件。紅細(xì)胞G6PD 缺乏者，在服用某些藥物(如抗在藥、酬類藥、伯氨哇附中、磺膠等)及食用蠶豆后，代謝產(chǎn)生的氧自由基，或與氧合血紅蛋白作用形成的H2O2使GSH 氧化成的琉基失去GSH

6、的保護(hù)，被氧化變性形成Heinz 小體。紅細(xì)胞膜失去疏基保護(hù)而功能受損，導(dǎo)致溶血。所以檢測患者G6PD，可以對(duì)多種溶血性病進(jìn)行早期診斷和早期預(yù)防。適用人群適用人群：新生兒及其父母：可以早期篩查新生兒是否缺乏G6PD，了解家庭遺傳方式?；闄z：分析后代可能缺乏G6PD的概率。溶血性疾病患者：鑒別和分析溶血性病類型和原因，有利于臨床采取適當(dāng)治療措施和藥物治療。2、G6PD的檢測方法的檢測方法 2.1 比色法（生化儀）比色法（生化儀）G6PD 活性校正值測定活性校正值測定原理：原理：紅細(xì)胞G6PD 催化G6P 生成6-磷酸葡萄糖內(nèi)脂，后者很快氧化成6-磷酸萄糖酸(6-PGA) ，同時(shí)NADP 被還原成

7、NADPH 。在340 nm 處監(jiān)視NADPH 吸光度的升高，計(jì)算酶的活性。紅細(xì)胞中還含有6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶( 6PGD)，催化6-PGA 脫羧，生成核酮體糖-5-磷酸，同時(shí)使輔酶NADP 還原成NADPH。在本測定系統(tǒng)中，由6-PGA和G6 P 組成的底物系統(tǒng)，測得的酶活性，減去單獨(dú)以6-PGA 為底物時(shí)測得的酶活性，代表真正G-6-PD 的活性。本法測定包含如下2 個(gè)反應(yīng)式:（1）G6P+ NADP+ 6PGA+NADPH+H+ (2) 6PGA+NADP+ R-5-P+NADPH+H+CO2 G6PD6-PGD血紅蛋白測定血紅蛋白測定氰化高鐵血紅蛋白測定法氰化高鐵血紅蛋白測定法原理：

8、原理： 血液在Hb轉(zhuǎn)化液中溶血后，除SHb外各種Hb均可被高鐵氰化鉀氧化為高鐵Hb再與CN-結(jié)合生成穩(wěn)定的棕紅色氰化高鐵Hb。HiCN最大波峰在540nm,最小吸收峰為504nm。特定標(biāo)準(zhǔn)條件下，毫摩爾消光系數(shù)為44Lmmol1cm。因此，根據(jù)標(biāo)本的吸光度，即可測定Hb濃度。 HiCN 試劑試劑:氰化鉀(KCN)高鐵氰化鉀無水磷酸二氫鉀特別提醒：該法是測定血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是試劑中含有氰化鉀劇毒物，特別提醒：該法是測定血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是試劑中含有氰化鉀劇毒物，操作時(shí)必須小心。實(shí)驗(yàn)后的廢液也要小心處理。操作時(shí)必須小心。實(shí)驗(yàn)后的廢液也要小心處理。G6PD活力計(jì)算：活力計(jì)算： G6PD=(

9、G6PD+6PGD )6PGD (U/L) G-6-PD , U/g Hb= G6PD/Hb意義：每克血紅蛋白中G6PD的活性參考值：參考值： 健康成年人，紅細(xì)胞G6PD 活性(己校正6-PGD) 8.341.59 U/g Hb 紅細(xì)胞活6PGD性為6.8 - 12.0U/g Hb注意一：注意一：NADPH比值法或比值法或G6PD/6GPD法，在上面基礎(chǔ)上不采用兩個(gè)指標(biāo)相法，在上面基礎(chǔ)上不采用兩個(gè)指標(biāo)相減，而是相除，原理是減，而是相除，原理是6GPD尚未報(bào)道在尚未報(bào)道在G6PD患者和正常人之間有差異，通患者和正常人之間有差異，通過比值法篩查，一定程度上可以確認(rèn)女性雜合子，也就是過比值法篩查，一

10、定程度上可以確認(rèn)女性雜合子，也就是G6PD基因缺陷攜基因缺陷攜帶者。此法受到一些試劑廠家和醫(yī)院青睞。帶者。此法受到一些試劑廠家和醫(yī)院青睞。G6PD 活性直接測定法活性直接測定法 G6PD 活性校正值測定雖然能提供G6PD 活性真值和6GPD的活性，但在溶血性疾病的檢查中尚未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞6PGD活性正常而掩蓋G6PD活性缺乏的現(xiàn)象。因此，就臨床使用而言，G6PD活性的的簡易測定法己能滿足臨床。原理：原理：G6P+ NADP+ 6PGA+NADPH+H+ 在波長340 nm 處監(jiān)測NADPH 的吸光度增高，計(jì)算G6PD活性?；钚杂?jì)算：活性計(jì)算： G-6-PD , U/g Hb= G6PD/Hb參考值

11、：參考值：健康成年人，紅細(xì)胞G6PD 活性為8 -18 U/g Hb 。注意：醫(yī)院可以根據(jù)需要決定是否需要注意：醫(yī)院可以根據(jù)需要決定是否需要6PGD校正。校正。 G6PD其他方法：其他方法：2.2高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn):2.3免疫斑點(diǎn)雜交法：免疫斑點(diǎn)雜交法：G6PD活性測定注意事項(xiàng)活性測定注意事項(xiàng)： 1、Mg2+是G6PD的激活劑，銅離子和鋅離子有輕度抑制作用，汞離子和對(duì)氯汞苯甲酸有完全抑制作用，因此日常使用中盡量避免抑制劑的污染。 2、避免樣本溶血，樣本溶血后G6PD活性不穩(wěn)定，影響其活性測定。溶血后活性降低很快，25min內(nèi)需要及時(shí)測定。五、華南常見五、華南常見G6PD試

12、劑盒概況試劑盒概況 目前，市場常見的生化儀比色試劑盒分為兩種方法，一是G6PD直接測定法（速率法），直接測量G6PD活性，二是NADPH比值法，測定G6PD/6PGD。有的試劑盒提供血紅蛋白測定試劑，多數(shù)沒有提供血紅蛋白測試試劑。 G6PD直接測定法的廠家有：直接測定法的廠家有： 寧波美康、北京利德曼、上海執(zhí)成、長春匯力、廣州科方 參考值：成人參考值：成人1300-3600U/L 兒童兒童1700-4000U/L NADPH比值法的廠家有：比值法的廠家有： 廣州科方、廣州米基 參考值：成人參考值：成人G6PD/6PGD 1.0-2.3（0.95-1.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查） 新

13、生兒（臍帶血、靜脈血）新生兒（臍帶血、靜脈血）1.1-2.5（1.05-2.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查）不同廠家試劑盒比較不同廠家試劑盒比較1、底物方面：、底物方面：長春匯力說明書反應(yīng)底物為G6PDNa2外，其它廠家為G6P，但是實(shí)際上兩者是同一物質(zhì)的不同叫法。2、樣本類型、樣本類型：寧波美康、上海執(zhí)成、北京利德曼采用壓積紅細(xì)胞，長春匯力、廣州科方、廣州米基可以采用全血、臍帶血，長春匯力還可以采用末梢血。3、參考值方面：、參考值方面： G6PD直接測定法一般為成人成人1300-3600U/L 兒童兒童1700-4000U/L NADPH比值法成人成人G6PD/6PGD 1.0-2.

14、3（0.95-1.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查） 新生兒（臍帶血、靜脈血）新生兒（臍帶血、靜脈血）1.1-2.5（1.05-2.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查）長春匯力與以上有所區(qū)別，具體如下：全血G6PD: 638-1980U/L 4.2-14.5U/gHb臍帶血或末梢血G6PD：832-2460U/L 4.9-14.5U/gHb血清G6PD：0-5U/L北京利德曼對(duì)參考值也規(guī)定的比較細(xì):EDTA抗凝血：1300U/L以上正常，600-1300U/L可疑，需要血紅蛋白校正。肝素抗凝血： 1100U/L以上正常，500-1100U/L可疑，需要血紅蛋白校正。每克血紅蛋白中G6PD活性： 3.8U/gHb4、G6PD活性校正活性校正：G6PD活性測定與血紅蛋白含量和紅細(xì)胞老幼有關(guān)，因此正確的做法是與血紅蛋白求比值來校正，長春匯力提供血紅蛋白試劑校正，其他均無此試劑。由于血紅蛋白測定有劇毒試劑以及占用通道和試劑，一般都不測定。G6PD/6PGD在篩查基因突變雜合子方面比較有優(yōu)勢，其他廠家沒有5、美康、美康G6PD測定副波長為測定副波長為660nm，其他為，其他為405nm。六、美康六、美康G6PD調(diào)試經(jīng)驗(yàn)調(diào)試經(jīng)驗(yàn)1、參數(shù)按照說明書，定標(biāo)方式有因子法，兩點(diǎn)定標(biāo)。試劑盒自帶定標(biāo)液，配有兩個(gè)水平質(zhì)控。定標(biāo)液定出K因子為230000左右，與理論