1、（一）膠體性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)分子量大，在水中不能成真溶液，成膠體分子量大，在水中不能成真溶液，成膠體溶液溶液透析透析：蛋白質(zhì)溶液放入半透膜內(nèi)放入水中：蛋白質(zhì)溶液放入半透膜內(nèi)放入水中讓其中雜質(zhì)擴散入水內(nèi)讓其中雜質(zhì)擴散入水內(nèi)（二）兩性解離（二）兩性解離末端末端自由自由-COOH和自由和自由-NH2鏈中可解離的鏈中可解離的側(cè)鏈基團側(cè)鏈基團（-NH2，-COOH，胍，胍基，咪唑基等）基，咪唑基等）-NH3+-COOHP-NH3+-COO-P-NH2-COO-P+H+-H+-H+H+正離子正離子 兩性離子兩性離子 負離子負離子等電點（等電點（pI）蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時溶液的蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時溶液的

2、pH值值并不是蛋白質(zhì)并不是蛋白質(zhì)自身電荷數(shù)自身電荷數(shù)最小時最小時必須在一定離子強度的必須在一定離子強度的緩沖液緩沖液中測定，等電中測定，等電點與緩沖液的種類、緩沖液的離子強度有關(guān)。點與緩沖液的種類、緩沖液的離子強度有關(guān)。 蛋白質(zhì)在不含任何其它溶質(zhì)的純水中的等電蛋白質(zhì)在不含任何其它溶質(zhì)的純水中的等電點稱點稱等離子點等離子點蛋白質(zhì)的等電點一般蛋白質(zhì)的等電點一般偏酸偏酸等電點時，蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度、導(dǎo)電性、粘度、溶解度、導(dǎo)電性、粘度、滲透壓最小滲透壓最小電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電荷的電極移動荷的電極移動（三）變性和凝固（三）

3、變性和凝固變性作用變性作用 天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，分子天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，分子內(nèi)部原有的高度規(guī)則性的空間排列發(fā)生變化，致內(nèi)部原有的高度規(guī)則性的空間排列發(fā)生變化，致使原有性質(zhì)和功能發(fā)生部分或全部喪失，稱使原有性質(zhì)和功能發(fā)生部分或全部喪失，稱變性變性作用作用。變性的蛋白質(zhì)分子相互凝集為固體的現(xiàn)象稱變性的蛋白質(zhì)分子相互凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固凝固變性的可逆性變性因素及其作用機制變性因素及其作用機制熱變性熱變性 破壞氫鍵破壞氫鍵酸堿酸堿 破壞鹽鍵破壞鹽鍵有機溶劑有機溶劑 降低介電常數(shù)；破壞疏水鍵降低介電常數(shù)；破壞疏水鍵尿素、胍尿素、胍 破壞氫鍵及疏水鍵破壞氫鍵及疏水鍵三氯乙酸三

4、氯乙酸 與蛋白質(zhì)形成溶解度很小的鹽與蛋白質(zhì)形成溶解度很小的鹽振蕩振蕩 表面作用表面作用變性蛋白質(zhì)的特征變性蛋白質(zhì)的特征結(jié)晶和生物活性消失結(jié)晶和生物活性消失溶解度顯著減小溶解度顯著減小粘度、旋光性增加，粘度、旋光性增加，pIpI提高提高反應(yīng)基團數(shù)目增加反應(yīng)基團數(shù)目增加易被酶消化易被酶消化變性的理論變性的理論中國科學(xué)家中國科學(xué)家 吳憲吳憲 19311931年年 變性蛋白質(zhì)其肽鏈由原來的變性蛋白質(zhì)其肽鏈由原來的緊密有序緊密有序的構(gòu)象的構(gòu)象變成變成松散無序松散無序的構(gòu)象的構(gòu)象別構(gòu)作用別構(gòu)作用( (變構(gòu)作用變構(gòu)作用) )概念概念 含亞基的蛋白質(zhì)由于一個亞基構(gòu)象的改含亞基的蛋白質(zhì)由于一個亞基構(gòu)象的改變而引

5、起其余亞基和整個分子構(gòu)象、性質(zhì)、變而引起其余亞基和整個分子構(gòu)象、性質(zhì)、功能發(fā)生改變的作用稱別構(gòu)作用功能發(fā)生改變的作用稱別構(gòu)作用血紅蛋白的別構(gòu)作用血紅蛋白的別構(gòu)作用沉淀作用沉淀作用加酸加酸鹽析鹽析有機溶劑有機溶劑加重金屬鹽加重金屬鹽生物堿試劑生物堿試劑抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)加熱加熱沉降作用沉降作用高速離心時，蛋白質(zhì)分子趨于下沉高速離心時，蛋白質(zhì)分子趨于下沉沉降速率沉降速率沉降常數(shù)沉降常數(shù)(s)每單位引力場沉降分子下沉的速度每單位引力場沉降分子下沉的速度1 Svedberg單位單位110-13 sec(一一) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)牛胰RNase

6、變性一復(fù)性實驗：124個a.a殘基 4個鏈內(nèi)二硫鍵。 分子量：12600 (8M尿素+硫基乙醇)變性、失活透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是1/105。( (二二) )蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系 細胞色素細胞色素C的種屬差異與生物進化的種屬差異與生物進化 鐮狀細胞貧血病的血紅蛋白鐮狀細胞貧血病的血紅蛋白HBS 鏈的第鏈的第6個氨基酸個氨基酸GluVal 酶原和激素原的激活酶原和激素原的激活同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進化同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進化同源蛋白質(zhì)：同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：

7、血紅蛋白在不同的脊椎動物中都具有輸送氧氣的功能，細胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)的特點：同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。多肽鏈長度相同或相近通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進化。親源關(guān)系越遠，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。1、 細胞色素細胞色素C 分子量：12500左右氨基酸殘基：100個左右，單鏈。25種生物中，細胞色

8、素C的不變殘基35個。60種生物中，細胞色素C的不變殘基27個。親源關(guān)系越近的，其細胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠的，其細胞色素C的差異越大。人與黑猩猩 0人與猴 1人與狗 10人與酵母 442、胰島素胰島素有24個氨基酸殘基位置始終不變：AB鏈上6個Cys 不變，其余18個氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。其它可變氨基酸對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對免疫反應(yīng)起作用。豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的突變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的突變分子病分子病分子?。夯蛲蛔円鸬哪硞€功能蛋白的某一個或幾個氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整

9、個分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。鐮刀形紅細胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val 正常人血紅蛋白，.N.Glu 6鐮刀型貧血 .N.Val 6生理條件下電荷： Glu- Va10 親水 疏水 一級結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活一級結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、 血液凝固的機理血液凝固的機理 凝血因子（凝血酶原致活因子） 凝血酶原 凝血酶 纖維蛋白原A 纖維蛋白B 凝膠（1）、）、 凝血酶原凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274Thr275、Arg323Ile324斷裂，釋放出48個a.a，產(chǎn)生活性凝血

10、酶。 A鏈49 a.a B鏈259 a.a（2）、）、 纖維蛋白原纖維蛋白原 22r2 從二條鏈和二條鏈的N端各斷裂一個特定的肽鍵-ArgGly-，釋放出二個纖維肽A（19個氨基酸）和二個纖維肽B（21個氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。 A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負電荷，促進分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價健（Gln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。 2、 胰島素原的激活胰島素原的激活 前胰島素原，含信號肽。胰島素原，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號肽被信號肽酶切除?；钚砸葝u素，高爾基體，切除C肽。指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)

11、的氨基酸殘指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或基團作某些改變從而改變蛋白質(zhì)的有關(guān)性基或基團作某些改變從而改變蛋白質(zhì)的有關(guān)性質(zhì)與功能質(zhì)與功能羥基氨基酸羥基氨基酸(Ser,Thr,Tyr)的的磷酸化磷酸化與與去磷酸化去磷酸化糖蛋白糖蛋白短鏈糖同蛋白質(zhì)以共價鍵連接而成的結(jié)合蛋白質(zhì)短鏈糖同蛋白質(zhì)以共價鍵連接而成的結(jié)合蛋白質(zhì)糖與蛋白質(zhì)的連接鍵糖與蛋白質(zhì)的連接鍵O-糖苷鍵糖苷鍵 糖的半縮醛羥基與糖的半縮醛羥基與Thr,Ser,Hypro,Hylys的羥基的羥基N-糖苷鍵糖苷鍵 糖的半縮醛羥基與糖的半縮醛羥基與Asn的氨基的氨基脂蛋白脂蛋白脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級鍵結(jié)合脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級鍵結(jié)合 脫輔基蛋白脫

12、輔基蛋白(載脂蛋白載脂蛋白 apo ) 脂質(zhì)脂質(zhì)細胞脂蛋白細胞脂蛋白血漿脂蛋白血漿脂蛋白v乳糜微粒乳糜微粒v極低密度脂蛋白極低密度脂蛋白(VLDL)v低密度脂蛋白低密度脂蛋白(LDL)v高密度脂蛋白高密度脂蛋白(HDL)低密度脂蛋白低密度脂蛋白(LDL)抗體抗體(Ig)， -球蛋白球蛋白分分5類，類，IgA, IgD, IgE, IgG, IgML 輕鏈輕鏈H 重鏈重鏈V VariableC Constant木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶切割位點切割位點抗原與抗體抗原與抗體抗原是指進入異體機體后，能致敏淋巴細胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白質(zhì)、核酸及其它高分子化合物）?？乖园?/p>

13、免疫原性和抗原特異性。免疫原性是指誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力。抗原特異性是指與抗體特異結(jié)合的能力?？乖瓫Q定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團決定（一級結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團稱抗原決定簇。抗原決定簇的作用：被免疫活性細胞識別，從而激活免疫活性細胞產(chǎn)生抗體。與相應(yīng)抗體的Fab結(jié)合?？贵w是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白?？贵w具有兩個特點：高度特異性多樣性幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，人體內(nèi)任一時刻約有10000種抗體存在?？乖贵w反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)抗體是2價的，抗原是多價的。抗

14、體極度過剩，抗原分子所有價被抗體的飽和，可溶。 抗原一抗體比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原抗體復(fù)合物，不可溶。 抗原極度過剩，抗體被飽和，可溶。 圖 抗原抗體反應(yīng)的條件：抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補。二者各有對應(yīng)的化學(xué)基團，通過作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵 等）Key and lockInteraction between antigen and antibodyAntibodyAntigenAntigenLabeled antigenAntigen ConcentrationRelative amount ofbound analogue in antibody-based immunoass

15、ays- the development of the competitive binding assay, using radioisotope and later enzyme-labeled immunoassays 基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Western印跡(Western blot)蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的任務(wù)蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的任務(wù)目的目的 提高蛋白質(zhì)的比活性提高蛋白質(zhì)的比活性原理原理 分子量；分子量； 溶解度；溶解度； 電荷；電荷； 吸附性質(zhì)；吸附性質(zhì)； 對其它分子的生物親和力對其它分子的生物親和力1 1 抽提抽提破細胞破細胞動

16、物組織動物組織 勻漿；反復(fù)凍融勻漿；反復(fù)凍融植物植物 研磨研磨細菌細菌 超聲波振蕩；研磨；溶菌酶超聲波振蕩；研磨；溶菌酶提取提取 pH：選擇合適選擇合適pH的緩沖液，如的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此在此pH條件下穩(wěn)定。條件下穩(wěn)定。 溫度：溫度：低溫如低溫如4-10，蛋白酶活性較低。，蛋白酶活性較低。 離子強度：離子強度：如如0.1-0.2 M NaCl或或KCl. 其他成分：其他成分：還原劑還原劑 NaHSO4，維生素，維生素C巰基保護劑巰基保護劑 DTT，巰基乙醇，巰基乙醇金屬螯合劑金屬螯合劑 EDT

17、A，EGTA蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑 PMSF分離細胞器分離細胞器如目的蛋白在某一細胞組分內(nèi)如目的蛋白在某一細胞組分內(nèi)( (細胞核、染色體、核糖體等細胞核、染色體、核糖體等) )除核酸除核酸酶法酶法DNase,RnaseDNase,Rnase超聲超聲除脂肪除脂肪丙酮丙酮脂肪酶脂肪酶除鹽除鹽超濾超濾凝膠過濾凝膠過濾凍干凍干2 2 分離分離粗分級粗分級 簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液等電點沉淀等電點沉淀鹽析鹽析 (NH4)2SO4沉淀沉淀稀釋沉淀稀釋沉淀有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀吸附吸附超濾超濾等電點沉淀等電點沉淀鹽析與鹽溶鹽析與鹽溶SolubilitypHpISolu

18、bilitySalt concentrationSalting inSalting out3 3 純化純化規(guī)模小，分辨率高規(guī)模小，分辨率高凝膠過濾凝膠過濾(分子篩層析、分子排阻層析分子篩層析、分子排阻層析) 利用蛋白質(zhì)分子量的不同利用蛋白質(zhì)分子量的不同 Sephadex Bio-Gel Sepharose凝膠過濾凝膠過濾大分子量的先出來大分子量的先出來小分子量的后出來小分子量的后出來 纖維素離子交換層析纖維素離子交換層析利用蛋白質(zhì)電荷的性質(zhì)利用蛋白質(zhì)電荷的性質(zhì)陽離子陽離子: 羧甲基纖維素羧甲基纖維素 (CM-) -O-CH2-COO陰離子陰離子: 二乙基氨基乙基纖維素二乙基氨基乙基纖維素 (D

19、EAE-) -O-CH2-CH2-NH(C2H5)2-+纖維素離子交換層析纖維素離子交換層析 親和層析親和層析蛋白質(zhì)能與特異的配體結(jié)合蛋白質(zhì)能與特異的配體結(jié)合( (專一、非共價、可逆專一、非共價、可逆) )配體常連接在瓊脂糖凝膠配體常連接在瓊脂糖凝膠(Sepharose)(Sepharose)上上配體選擇：配體選擇：抗原抗原抗體抗體酶酶抑制劑抑制劑酶酶底物底物激素激素受體受體金屬結(jié)合蛋白金屬結(jié)合蛋白螯和劑螯和劑糖蛋白糖蛋白凝集素凝集素親和層析是最好的純化方法親和層析是最好的純化方法之一之一 電泳法電泳法電泳是指帶電粒子在直流電場中移動的現(xiàn)象。電泳是指帶電粒子在直流電場中移動的現(xiàn)象。最常用：最常

20、用：聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種利用人工合成的凝膠作為聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰丙烯酰胺胺和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)過聚合交聯(lián)從而形經(jīng)過聚合交聯(lián)從而形成的三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)。成的三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)的電荷、分子量和形電荷、分子量和形狀狀超離心法超離心法結(jié)晶法結(jié)晶法HPLC(HPLC(高壓液相色譜高壓液相色譜) )4 4 鑒定鑒定純度鑒定純度鑒定 PAGE HPLC

21、 結(jié)晶結(jié)晶 超離心超離心 N-端測定端測定分子量測定分子量測定 凝膠過濾凝膠過濾 LgMLgM洗出液體積洗出液體積 作圖作圖 SDS-PAGESDS-PAGE LgM LgM相對電泳遷移率相對電泳遷移率 作圖作圖SDS-PAGE如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小，當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在取決于蛋白質(zhì)的分子量大小，當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15，000200，000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合如下方程式：呈線性關(guān)系，符合如下方程式： lg MW = b m R + K 其中，其中，