1、長春中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文鹿茸多肽治療骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究 姓名:程目強申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):中醫(yī)骨傷科學(xué)指導(dǎo)教師:趙文海20090301長春中醫(yī)藥大學(xué) 2009屆碩士學(xué)位論文 英文縮略語 英 文 縮 略 語英文縮寫 英文全稱 中文名詞OAOsteoarthritis 骨性關(guān)節(jié)炎OC OsteoarthritisChondrocytes 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞 V APs Velvet antler polypeptides 鹿茸多肽Col Collagen 膠原GAG Glycosaminoglycans 糖胺多糖PGsProteoglycans 蛋白多糖IMDM Iscoves Modifi

2、ed Dulbeccos Medium IMDM (培養(yǎng)基 MMPs MatrixMetalloproteinases 基質(zhì)金屬蛋白酶長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文,是個人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下,獨立進行研究工作所取得的成果。 除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外,本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品 成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體,均已在文中以明確方式標明并致謝。本人完全意 識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名年 月 日 關(guān)于學(xué)位論文成果歸屬權(quán)的聲明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文,是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下自選課題或?qū)煶袚?dān)的國家立項資助

3、的計劃課題的一部分,系本人在導(dǎo)師指導(dǎo)和資助下獨立進行研究工作所取得的成果,歸屬權(quán)為長春 中醫(yī)藥大學(xué)和本人導(dǎo)師所有。特此聲明,本聲明的一切法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名 指導(dǎo)教師簽名年 月 日 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解長春中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向 中國科學(xué)技術(shù) 信息研究所 及 中國學(xué)術(shù)期刊(光盤版 電子雜志社 送交論文的復(fù)印件和電子版, 允許被查閱和借閱。 本人授權(quán)長春中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入 中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 及 中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 進行檢索,可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯 編本學(xué)位論文。(保密論

4、文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定論文作者簽名 指導(dǎo)教師簽名年 月 日中 文 摘 要目的:探索鹿茸多肽促進骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及維持新增殖軟骨細胞正常表型 的作用方法:取 24只新西蘭大白兔,雌雄各半,平均分成 8組,每組 3只。兩只按照 Hulth 法 1稍作改動后制作動物模型,在兔雙后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做橫向切口,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶,切 斷前交叉韌帶,并全部切除內(nèi)側(cè)半月板;另外 1只做假手術(shù),不切斷前交叉韌帶,也不 切除內(nèi)側(cè)半月板。每周制作一組模型。從第 9周開始,每周處死一組動物,手術(shù)截取兔 膝關(guān)節(jié),分離培養(yǎng)軟骨細胞。由假手術(shù)動物雙后膝關(guān)節(jié)分離獲得的軟骨細胞作為正常對 照組,由模型動物分離獲得的軟骨細胞分為:

5、模型組、鹿茸多肽低劑量組、鹿茸多肽中 劑量組、鹿茸多肽高劑量組。正常對照組和模型組中加入 10%IMDM正常培養(yǎng)液,鹿茸 多肽低、中、高劑量組分別加入 6g/ML鹿茸多肽、 12g/ML鹿茸多肽、 24g/ML鹿茸多 肽,繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。通過 MTT 法測定軟骨細胞增殖、甲苯胺藍染色鑒定細胞表型、 型膠原免疫組化染色的方法來檢驗鹿茸多肽促進骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及維持新 增殖軟骨細胞正常表型的作用。結(jié)果:鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖沒有明顯促進作用;鹿茸多肽可以明顯 提高骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì)中的糖氨多糖和 型膠原含量。結(jié)論:軟骨細胞的正常表型表達,是軟骨基質(zhì)保持穩(wěn)定的基礎(chǔ),軟骨細胞功

6、能的異 常是骨性關(guān)節(jié)炎變化的開始和關(guān)鍵。 本研究利用家兔骨性關(guān)節(jié)炎模型分離獲得骨關(guān)節(jié)炎 軟骨細胞,并在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中加入不同濃度的鹿茸多肽進行干預(yù)。結(jié)果表明:鹿 茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖沒有明顯促進作用, 可能由于某些因素掩蓋了鹿茸多 肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的促增殖效果,還有待于進一步研究;鹿茸多肽可以明顯提高 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì)中的糖氨多糖和 型膠原含量。提示:鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié) 炎軟骨細胞增殖沒有明顯促進作用, 但對維持新增殖軟骨細胞正常表型起到正向調(diào)節(jié)作 用。關(guān)鍵詞 骨性關(guān)節(jié)炎 鹿茸多肽 軟骨細胞 糖氨多糖 型膠原ABSTRACTPurpose: To study eff

7、ective function mechanism of Pilose antler peptide on OAMethod: Twenty fours New Zealands rabbits, Male and female fifty-fifty, Divide them into 8 set averagely ,3 per set. The animal model of OA was induced by Hulths method in animals of experiment group, Another one dont operation. Make a group of

8、 model weekly. From ninth, the cycle begins, we kill a group of rabbit weekly. Make and cultivate the OC, and we divide them into 5 set. Be respectively: control group、 model group、 V APs6g/ML group、 V APs12g/ML group and V APs24g/ML group. Part for add the chemical reagent. At last we pass fixed me

9、thod to check the results.Result: Velvet antler polypeptides is not benefit to Osteoarthritis Chondrocytess Breed. Velvet antler polypeptides can improve the GAG and Col proportions, which in the Osteoarthritis Chondrocytes.Conclusion: Chondrocytes is the basis of ECM. If the Chondrocyte cant work r

10、egularly., Osteoarthritis will be Happened. So that, Chondrocytes is important to the Osteoarthritis. This experiment can show that Velvet antler polypeptides is not benefit to Osteoarthritis Chondrocytess Breed. Velvet antler polypeptides can improve the GAG and Col proportions, which in the Osteoa

11、rthritis Chondrocytes.Keyword: Osteoarthritis; Velvet antler polypeptides; Osteoarthritis Chondrocytes; Glycosaminoglycans; Type Collagen前 言骨性關(guān)節(jié)炎 (Osteoarthritis,OA是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一,以關(guān)節(jié)軟骨 的退行性變?yōu)橹饕±硖卣?常見癥狀為受累關(guān)節(jié)疼痛,活動受限,休息后緩解,晨起 有僵硬感等。骨性關(guān)節(jié)炎嚴重影響老年患者的行走、上下樓梯和其它下肢功能,嚴重者 可造成關(guān)節(jié)殘疾。 不僅影響老年患者的生活質(zhì)量, 而且造成國民經(jīng)濟的損

12、失 2。 據(jù)報道, 美國約有二千萬骨性關(guān)節(jié)炎病人,是致殘重要原因之一 。 65歲以上老人 70%有骨性關(guān) 節(jié)炎癥狀 ,其中 46%喪失部分關(guān)節(jié)功能及勞動能力,足見其危害性之大。我國已進入 老齡社會,骨性關(guān)節(jié)炎的社會問題與衛(wèi)生保健問題必將會變得愈加嚴重。近年來,對骨性關(guān)節(jié)炎的研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,并且也取得了豐碩的 成果。普遍認為在骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程中既有退行性改變,同時還有關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)的修 復(fù)、關(guān)節(jié)形狀的修復(fù)、負重表面的重新分布和穩(wěn)定的重建。但以往大多數(shù)學(xué)者認為破壞 較修復(fù)更快,最終使關(guān)節(jié)面逐漸被侵蝕,認為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變及破壞是其基本病 變。導(dǎo)師趙文海教授從事骨科臨床、科研、教

13、學(xué)幾十年,積累了淵博的學(xué)識,本著實事 求是的科研精神,通過孜孜不倦的努力,以及精益求精的探索,對骨性關(guān)節(jié)炎有著獨到 的見解,并提出了 “ 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝修復(fù)紊亂假說 ” ,本課題是作為驗證此假說的一 部分實驗研究。 趙教授認為:在祖國醫(yī)學(xué)中, 關(guān)節(jié)軟骨屬 “ 筋 ” 的范疇, 隨著年齡的增長, 腎藏精及肝藏血漸顯不足,肝腎虧虛,影響到主骨養(yǎng)筋的功能,軟骨充養(yǎng)欠乏,加之外 來因素作用,軟骨細胞發(fā)生損傷,受損的軟骨細胞發(fā)生變性,細胞內(nèi)合成調(diào)控機制發(fā)生 改變,軟骨細胞分泌的相關(guān)蛋白及胞外基質(zhì)成分發(fā)生異常表達,胞外基質(zhì)表達異常使正 常軟骨細胞代謝發(fā)生改變,增生修復(fù)與降解出現(xiàn)紊亂,骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

14、鹿茸作為祖國醫(yī)學(xué)寶庫中的精華,是產(chǎn)自長白山的名貴中藥材,作為臨床治療骨病 的中藥在我國已有幾千年的歷史。而鹿茸多肽就是在鹿茸中提取出的一類生物活性物 質(zhì)。研究證明,鹿茸多肽對骨、 軟骨細胞有明顯的促增殖分裂活性 3,4,并且有促進傷口 愈合、提高免疫功能、抗氧化、抗炎等多方面的藥理活性。但作為生長因子類藥物,其 促進再生和加速創(chuàng)傷愈合功能給人們留下了深刻的印象。本研究擬在上述研究的基礎(chǔ) 上, 觀察鹿茸多肽促進骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及維持軟骨細胞正常表型的作用。 為 “ 骨 性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝修復(fù)紊亂假說 ” 提供一定的理論依據(jù),并為今后骨性關(guān)節(jié)炎的臨床治 療和新藥研發(fā)做出貢獻。文 獻 綜 述一

15、中醫(yī)藥對骨性關(guān)節(jié)炎的研究進展從中醫(yī)學(xué)角度分析, 骨性關(guān)節(jié)炎屬于 “ 痹證 ” 范疇。 素問 長刺節(jié)論 指出:“ 病在骨, 骨重不可舉,骨髓酸痛,寒氣至,名曰骨痹 ” ; 張氏醫(yī)通曰:“ 膝為筋之府 ” 、 “ 膝痛無 有不因肝腎虛者 ” 。中醫(yī)認為腎主骨 、肝主筋,人至中年后,肝腎漸虧,筋骨失養(yǎng),不 榮則痛;加之風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲留駐關(guān)節(jié),或跌仆扭傷,導(dǎo)致骨脈瘀滯,不通則痛。肝 腎虧虛是本病發(fā)病基礎(chǔ),風(fēng)寒濕邪侵襲及跌仆扭傷為發(fā)病誘因,故治療本病,關(guān)鍵在于 補益肝腎、祛風(fēng)散寒除濕。對于本病的治療目前主要分為內(nèi)治法和外治法兩大類。 1內(nèi)治法近年來,內(nèi)治法的報道較多,主要分辨證分型和專方治療兩大門派。

16、1.1辨證分型治療主張辨證分型治療的醫(yī)家又各有不同見解,趙昌林等 5采用白芥子散 (白芥子、土 鱉蟲、穿山甲、紅花等 治療膝骨性關(guān)節(jié)炎 90例,根據(jù)不同證型,分別加減藥物組成, 總有效率 86.7%。吳林生等 6將本病分為 7型:行痹、著痹、痛痹、熱痹、郁痹、虛痹 之氣血不足型、虛痹之肝腎兩虧型,根據(jù)證型不同施以辯證論治。張建福 7將本病分為 6型:寒濕阻滯型、濕熱蘊結(jié)型、氣虛血衰型、肝腎虧虛型、熱毒內(nèi)攻型、瘀血蓄積型, 根據(jù)證型特點采用不同治法。1.2專方治療擅用專方治療的醫(yī)家有以下幾位代表,陳炳坤 8以當歸四逆湯為主加減治療本病, 療效滿意,他認為該方劑對應(yīng)證候為虛、瘀、寒,同時認為本病患

17、者多為中老年人,膝 關(guān)節(jié)往往有不同程度的勞損,偶爾通過輕微暴力而致傷,不能冒然辨證為氣滯血瘀,否 則易犯虛虛實實之戒。熊越海等 9用自擬膝痹舒通飲辨證加減并配合當歸注射液穴位注 射治療膝骨性關(guān)節(jié)炎 30例,總有效率 96.7%。顧玉潛等 10用獨活寄生湯治療膝關(guān)節(jié)骨 性關(guān)節(jié)炎 60例,總有效率達到 93.3%,明顯優(yōu)于西藥對照組。許書亮等 11自擬骨炎湯, 治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者 158例,總有效率達 89. 2%。楊久山等 12自擬通痹湯,從 清熱化痰祛瘀立意,治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎伴關(guān)節(jié)積液,療效顯著。2 外治法2.1針灸療法治療骨性關(guān)節(jié)炎針灸治療本病報道較多,各家方法迥異,可分為毫針刺法

18、、刺絡(luò)拔罐法、火針溫灸法、水針穴位注射法等。他們在取穴上較相似,常取梁丘、血海、膝眼、委中、陽陵 泉、陰陵泉等。褚建平 13根據(jù) 靈樞 官針 “ 合谷刺,左右雞足,針于分肉之間,以 取肌痹,脾之應(yīng)也 ” 的論述,采用合谷刺的手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎,作者認為合谷 刺能糾正膝周各肌群間力平衡,緩解肌肉、韌帶的緊張牽拉狀態(tài),從而改善關(guān)節(jié)功能, 減輕原發(fā)病變引起的關(guān)節(jié)疼痛。 孫學(xué)東 14采取膝周穴位圍刺配合艾灸的方法。 宋亞光 15采取紅外線燈照射委中穴和壓痛點后,用梅花針刺絡(luò)拔罐的方法治療本病。丁明暉 16通過應(yīng)用溫針灸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎,確實能起到溫補陽氣、祛風(fēng)除濕、消腫止痛, 改善關(guān)節(jié)功能的

19、作用。 楊夢林等 17用中藥內(nèi)服及藥渣外敷膝關(guān)節(jié)和針刺治療膝骨性關(guān)節(jié) 炎 164例,總有效率 98.8%。2.2其他外治法推拿同樣對本病有著顯著的療效,各種手法多以活血通絡(luò)止痛為目的。鄧偉等 18采用手法按摩松筋、搖膝、還原等方法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎 60例,總有效率達 90.00%; 近年來在本病治療中也使用了中藥離子透入法, 如張秀華等 19采用北京產(chǎn) GA1A 低中 頻治療機治療 36例;李建飛等 20人利用玻璃酸鈉關(guān)節(jié)內(nèi)注射配合中藥熏蒸治療 OA , 同樣取得很好的療效。李澎等 21對 59例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者進行人工全膝關(guān)節(jié)表面 置換治療,均較好地改善膝關(guān)節(jié)功能。關(guān)俊輝等 22用國產(chǎn)

20、TQ98B 型汽化熱療器治療 本病,同樣取得了不錯的效果;沈惠風(fēng)等 23應(yīng)用南京中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠生產(chǎn)的 “ 復(fù)方南 星止痛膏 ” ,治療寒濕瘀阻型膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎 30例,有效 l1例。二 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對骨性關(guān)節(jié)炎研究進展1正常關(guān)節(jié)軟骨的生化1.1軟骨結(jié)構(gòu)透明軟骨和滑膜是關(guān)節(jié)中的兩個主要組織。透明軟骨由軟骨細胞外基質(zhì) (ECM (99 % 和軟骨細胞 (1% 組成?；|(zhì)由軟骨細胞合成的,含有膠原纖維和蛋白多糖。膠原中 主要是 型膠原纖維,通常以 3條 型膠原纖維構(gòu)成螺旋分子,排列規(guī)則 24。這些膠原 纖維分為多層:表層平行于關(guān)節(jié)連接的表面,最深層的纖維幾乎垂直插入軟骨骨板下的 骨內(nèi), 較深層的纖維

21、排列較隨意, 它們支持垂直纖維, 軟骨骨細胞沿膠原纖維走行排列, 位于其間 25。不同方向的纖維共同組成網(wǎng)狀拱型結(jié)構(gòu),維持著軟骨的構(gòu)形,并賦予組織 一定的抗張強度, 對應(yīng)力傳導(dǎo)有重要作用。 關(guān)節(jié)軟骨具有一定的代謝活動, 受多種化學(xué)、 物理及免疫學(xué)因素的影響。健康的關(guān)節(jié)軟骨處于一種合成與降解的精確的動態(tài)平衡中, 這種平衡一旦被破壞,將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。1.2軟骨細胞關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞密度極低,且隨著年齡的增加而減少。軟骨細胞被細胞外基質(zhì) 所包繞, 容納于基質(zhì)軟骨陷窩。 軟骨細胞因在軟骨組織中的存在部位不同, 其形態(tài)亦異。 軟骨細胞的大小、形狀及單位體積內(nèi)的細胞數(shù)量從表層到深層均不相同。近軟骨表面是

22、 一些幼稚的細胞,體小呈扁橢圓形,細胞長軸與軟骨表面平行,多為單個存在。越向深 層,軟骨細胞逐漸長大,變成圓形或橢圓形,軟骨表層細胞扁小,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)欠發(fā)達,線粒 體少,而深層軟骨細胞呈橢圓形,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達,線粒體多,因而深層軟骨細胞比表層的 軟骨細胞蛋白質(zhì)合成的功能旺盛。鈣化層的軟骨細胞為肥大軟骨細胞,且因其含有抗血 管形成的物質(zhì),因而能抵抗血管對軟骨的侵蝕,形成骨和軟骨間的重要緩沖帶。關(guān)節(jié)軟 骨不是靜止的組織,軟骨細胞具有合成和降解細胞外基質(zhì)成分的功能,是關(guān)節(jié)軟骨代謝 的活性成分。關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在由軟骨細胞介導(dǎo)的內(nèi)部動態(tài)改建系統(tǒng),在許多因素的參與 下,如通過細胞因子和生長因子的作用,精確調(diào)節(jié)蛋白酶和

23、蛋白酶抑制劑的含量,以保 持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。近來研究表明,軟骨細胞能通過細胞膜上特異受體控制周圍細胞的定 位分布,調(diào)節(jié)周圍基質(zhì)成分的合理分布 26。1.3軟骨基質(zhì)關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)由膠原、蛋白多糖和水構(gòu)成。細胞外基質(zhì)總是處于分解代謝和 合成代謝的動態(tài)平衡之中, 其成分在不同的個體、 部位、 濃度和年齡等情況下均有差異。 同時,細胞外基質(zhì)也會影響軟骨細胞的活動,包括細胞激動、增殖及分化。軟骨基質(zhì)成 分的任何變化都會影響軟骨細胞的生物學(xué)特性。1.3.1膠原 (Collagen膠原約占軟骨干重的 48-62%,透明軟骨的膠原主要是 型膠原。通常以 3條 型 膠原纖維構(gòu)成螺旋分子,聚合之后形成膠原纖維束

24、,通過編織、交聯(lián)及與核心蛋白結(jié)合 在一起,維持軟骨的抗壓力、抗剪力強度和形狀,限制由蛋白多糖聚體所產(chǎn)生的內(nèi)部膨 脹壓。關(guān)節(jié)軟骨膠原是有次序地排列的。軟骨表層的膠原維束與關(guān)節(jié)表面平行,不僅可 作為限制膜,也可分散所承負的壓力;軟骨層的膠原纖維束與表面垂直,把未鈣化的軟 骨栓在鈣化區(qū)或軟骨下骨板上, 中間區(qū)的膠原纖維排列較為隨意, 一般呈束狀斜形排列, 有利于抵抗張力。軟骨各區(qū)帶尚含有少量 型、 型和 型膠原等。 型膠原散在分布 于軟細胞外基質(zhì)中,在 型膠原之間及其他細胞外基質(zhì)成分之間連接上起重要用,穩(wěn)定 纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 型膠原多分布于軟骨細胞周圍,可能參與胞外質(zhì)纖維支架的構(gòu)筑。 型膠原在正常軟骨

25、中不存在, 只有肥大軟骨細胞才合成, 它是肥大軟骨細胞表型的標志。它能保護 型膠原在軟骨鈣化中不鈣化。1.3.2蛋白多糖 (proteoglycans, PGs蛋 白 多 糖 約 占 透 明 軟 骨 干 重 的 20%-40%, 它 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 是 糖 胺 多 糖 (glycosaminoglycans, GAG 。糖胺多糖的糖鏈由 4-硫酸軟骨素、 6-硫酸軟骨素和硫酸角 質(zhì)素組成,它們沿核心蛋白非對稱性分布。其鏈的長短和比例可隨年齡、發(fā)育或疾病而 改變。糖鏈帶有大量負電荷,親水性極強,具有蓄水和限制大分子物質(zhì)通透的作用。 2骨性關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制近年來對于骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)

26、病機制有著很多的研究, 雖然目前對骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病 機制尚不清晰,但諸多研究表明骨性關(guān)節(jié)炎并不是以往想象的簡單的 “ 退化 ” 、 “ 破壞 ” 過 程,而是破壞與修復(fù)并存的復(fù)雜過程 27。趙文海教授提出的 “ 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝修復(fù) 紊亂假說 ” 也是與這種觀點一致。2.1骨性關(guān)節(jié)炎的病因按致病因素,骨性關(guān)節(jié)炎可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種:(1原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎:是指機體關(guān)節(jié)常年應(yīng)力不均而發(fā)生退行性改變,隨著年齡的增長,結(jié)締組織易發(fā)生退行 性改變,蛋白多糖逐漸丟失,將膠原纖微暴露于外在壓力之下而變得脆弱,關(guān)節(jié)軟骨的 抗摩擦作用下降 ,因承受不均應(yīng)力軟骨出現(xiàn)破壞。肥胖 、關(guān)節(jié)的慢性老化損壞也是發(fā) 病

27、因素,另外也與遺傳有關(guān),現(xiàn)已明確是常染色體單基因遺傳病,女性為顯性。(2 繼發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎:創(chuàng)傷、 畸形和疾病都能造成軟骨的損害而導(dǎo)致日后的骨性關(guān)節(jié)炎。 骨性關(guān)節(jié)炎的病因不是單一因素,而是多種因素共同作用的結(jié)果。2.2骨性關(guān)節(jié)炎的臨床臨床上, OA 以關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、活動受限、骨磨擦音、可有滲出及不同程度的局 部炎癥表現(xiàn)。病理上,以不規(guī)則軟骨損害、在負重區(qū)域的軟骨下骨硬化、軟骨下囊腫、 邊緣骨贅增生、干骺端血流增加及不同程度的滑膜炎為特征。組織學(xué)上,早期以軟骨表 面碎裂、軟骨細胞增生、軟骨面縱向裂開、結(jié)晶沉積,以及同時存在的軟骨修復(fù)、骨贅 增生為特征;晚期出現(xiàn)軟骨的徹底破壞,表現(xiàn)為軟骨硬化、軟

28、骨消失及軟骨下局灶性骨 壞死。生物力學(xué)上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的可伸張性、抗壓力及抗剪切力及軟骨通透性降低、 軟骨水分增加、過度腫脹、軟骨下骨硬化。生化特征的改變?yōu)?PGs 的含量 (濃度 下降, 其分子大小和聚集度改變,膠原纖維的大小、排列以及基質(zhì)大分子的合成和降解均出現(xiàn) 異常改變。 1994年的美國骨性關(guān)節(jié)炎研討會上, 對骨性關(guān)節(jié)炎作了更為簡明的定義:骨 性關(guān)節(jié)炎是一組有不同病因但有相似的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)的疾病。該病不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損害,還累及整個關(guān)節(jié),包括軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌 肉。終至關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、潰瘍及整個關(guān)節(jié)面的損害。這一新的定義不僅 在文字上較前者

29、精煉,而且它強調(diào)了骨性關(guān)節(jié)炎不只是單一組織的一種疾病。骨性關(guān)節(jié) 炎涉及了關(guān)節(jié)所有的組成部分,包括關(guān)節(jié)本身及其周圍所有的組織。2.3骨性關(guān)節(jié)炎的病理特點從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究看,骨性關(guān)節(jié)炎的病理特征是病變關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生緩慢、漸進性的退 變。引發(fā)該病的初始因素是膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)平衡的改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)應(yīng)力的變化,引起關(guān)節(jié) 軟骨細胞的代謝紊亂。 由此產(chǎn)生各種蛋白酶等局部因子, 分解軟骨基質(zhì)中的膠質(zhì)和 GAG , 分解代謝大于合成代謝,從而使軟骨基質(zhì)喪失,甚至軟骨全層消蝕 28。在關(guān)節(jié)表面、邊 緣及軟骨下形成新骨 29。 OA 早期關(guān)節(jié)軟骨有小裂隙,少量簇聚的軟骨細胞和單個肥大 的軟骨細胞,潮線斷裂,或出現(xiàn)雙重潮線。中

30、期有裂隙深達中、深層,細胞致密,核膜 不清,排列紊亂,有大量簇聚軟骨細胞和肥大軟骨細胞。后期軟骨有深至軟骨下骨的裂 隙,表層不完整甚至缺失,軟骨下骨外露,有骨贅或象牙骨形成;細胞少,排列無層次 感,有大量簇聚軟骨細胞,潮線消失;基質(zhì)染色明顯不均,細胞的電子密度明顯增加, 胞核、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)無法辨認,可見核固縮、碎裂或溶解,可見壞死軟骨細胞。軟骨退變磨 損、骨質(zhì)硬化、囊變、骨贅形成,關(guān)節(jié)肥大變形,構(gòu)成了骨性關(guān)節(jié)炎的病理核心 30, 導(dǎo)致一系列與之相關(guān)的臨床癥狀。2.4骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)的發(fā)展,骨性關(guān)節(jié)炎動物模型的建立,研究者發(fā) 現(xiàn)生物力學(xué)因素、氧化損傷、金屬蛋白酶、細胞

31、因子、性激素、骨內(nèi)高壓等在以的發(fā)病 過程中也起著十分重要的作用。2.4.1生物力學(xué)平衡改變生物力學(xué)平衡改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)應(yīng)力變化引起負荷傳遞紊亂可致骨關(guān)節(jié)軟骨損傷、退 變,引起細胞代謝紊亂 31。當負荷傳遞紊亂發(fā)生時,軟骨基質(zhì)正常拱形結(jié)構(gòu)遭到破壞, 軟骨細胞失去保護而受損。當關(guān)節(jié)軟骨負荷增加時,一方面使關(guān)節(jié)內(nèi)壓力增加,影響滑 膜分泌滑液,使軟骨從關(guān)節(jié)液中獲取的營養(yǎng)減少;另一方面軟骨組織內(nèi)水分外溢,因而 使軟骨處于缺乏營養(yǎng)和水份的環(huán)境中,造成軟骨細胞固縮、碎裂和壞死。由此產(chǎn)生各種 蛋白酶等局部因子,分解軟骨基質(zhì)中的膠原和多糖,使軟骨基質(zhì)喪失,更進一步加劇軟 骨細胞的破壞,產(chǎn)生惡性循環(huán),而最后形成肉眼可

32、見的軟骨破壞與缺損。生物力學(xué)改變 是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要誘因之一,研究骨性關(guān)節(jié)炎制作動物模型時,手術(shù)法破壞關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性就是基于這一原理。2.4.2膠原與骨性關(guān)節(jié)炎膠原是細胞外基質(zhì)成分之一,屬纖維蛋白質(zhì)。不同類型膠原在分布、結(jié)構(gòu)、形態(tài)與 功能上各不相同,在關(guān)節(jié)軟骨中目前至少發(fā)現(xiàn)特異基因編碼的 8種不同型膠原。其中與 骨性關(guān)節(jié)炎最為密切的膠原為 、 、 、 、 型膠原。一般認為, 、 和 是功 能靜息性軟骨細胞的標志,而 、 和 型膠原則表明軟骨細胞發(fā)生了分化 32,33。正常 成人關(guān)節(jié)軟骨細胞不表達 I 型膠原 mRNA ,不合成 I 型膠原。 型膠原是非原纖維形成 性膠原,長度僅為間質(zhì)膠原 (

33、如 型膠原 的一半。 Walker 等 34用免疫組織化學(xué)方法研究 發(fā)現(xiàn),在骨性關(guān)節(jié)炎中 型膠原可以在鈣化帶及其上層表達,另外也可在靜止層 (靜止 層不涉及軟骨細胞的鈣化與礦化功能 表達。因為骨性關(guān)節(jié)炎時,表層細胞外基質(zhì)的破 壞,刺激肥大軟骨細胞的表型發(fā)生改變。同樣, Gibson 等 35研究結(jié)果提示:在大部分骨 性關(guān)節(jié)炎病人的軟骨下層區(qū)域可以看到 型膠原。這是因為隨著骨性關(guān)節(jié)炎的進展,關(guān) 節(jié)軟骨進一步破壞, OA 的更新與表面完整性的破壞與軟骨細胞的活性有關(guān),這些是與 未成熟關(guān)節(jié)軟骨相似的。在骨性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)軟骨中,局部軟骨細胞早熟,進一步 分化成肥大軟骨細胞。免疫染色 型膠原的分布是

34、不規(guī)則的,而且定位于軟骨細胞團周 圍,在正常軟骨鈣化區(qū)不可見 型膠原,新鮮分離的 OA 軟骨細胞明顯合成 型膠原, 同時可能對 型膠原的合成有一定的調(diào)控作用 36。 型膠原對骨性關(guān)節(jié)炎的生理作用可 能是通過間接途徑而非直接途徑來發(fā)揮其生理作用的, 其中之一是通過改變基質(zhì)分子間 的相互作用; 而且 型膠原表型表達的改變以致于軟骨細胞團的出現(xiàn) 37。 骨性關(guān)節(jié)炎時, 關(guān)節(jié)軟骨的 型膠原表達的增多是已經(jīng)肯定的事實,其發(fā)生的原因是多方面的:一種可 能是骨性關(guān)節(jié)炎時生長因子與細胞因子對軟骨細胞的刺激作用誘導(dǎo)軟骨細胞分化成肥 大細胞,不再合成由 、 型膠原、硫酸軟骨素、蛋白聚糖組成的功能性軟骨成分。另 一

35、種可能是骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外周環(huán)境的變化可能是分化的一個潛在誘導(dǎo)因素 38,39。 也有可能是 型膠原合成的增加改變了軟骨基質(zhì)的微環(huán)境,進而促進其退化;或者是 型膠原影響了軟骨基質(zhì)的穩(wěn)定性,以利于鈣化。雖然其中的確切原因尚不清楚,但確實 觀察到軟骨基質(zhì)退化后期 型膠原表達的增加。2.4.3蛋白酶與骨性關(guān)節(jié)炎在正常軟骨中,軟骨細胞會把合成的大量 型膠原、蛋白多糖等物質(zhì)分泌到細胞外 基質(zhì)中,構(gòu)成細胞外纖維網(wǎng)架,給細胞提供支持與保護。這些物質(zhì)最終在基質(zhì)金屬蛋白 酶 (MMPs的作用下降解。正常情況下,關(guān)節(jié)軟骨的分解代謝和合成代謝是處于動態(tài)平衡狀態(tài)的,這樣才能保證關(guān)節(jié)軟骨的質(zhì)和量。然而,當局部的分解代

36、謝因子超過合成代 謝因子,平衡就向軟骨降解方向轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致膠原和蛋白多糖的丟失 40,41。2.4.4活性氧與骨性關(guān)節(jié)炎氧自由基超氧化物陰離子自由基,單線態(tài)氧、輕自由基等,都是引起脂質(zhì)過氧化自 由基的氧化劑。氧自由基參與骨性關(guān)節(jié)炎病理過程,在其中起重要的參與作用。其一, 氧自由基對軟骨細胞的損傷作用。 其二, 氧自由基引起滑液粘度降低, 導(dǎo)致軟骨損傷 42。 其三,氧自由基的過量生成與微循環(huán)障礙有密切關(guān)系 43。其四,近年來研究表明 44,在 關(guān)節(jié)軟骨細胞中氧自由基與 NO 之間的平衡狀態(tài)是決定軟骨細胞死亡轉(zhuǎn)歸的重要因素, 高水平的 NO 使軟骨細胞凋亡,而氧自由基過高則引起軟骨細胞壞死。2.4

37、.5細胞凋亡和活性氧凋亡又稱程序性死亡,是細胞正常死亡的重要形式。細胞凋亡的途徑主要有 NO 和 Fas 兩種。 NO 通過兩種方式造成組織及細胞損傷, 一是高濃度的 NO 能抑制多種與線粒 體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是 NO 與超氧化陰離子 O l-反應(yīng), 生成氧化亞硝基陰離子 ONOO-, 在酸性條件下 (如病理條 件 迅速分解為 OH-和 NO 自由基。這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細 胞損傷。而 Fas 即 APO 或 CD95,是 I 型膜蛋白, Fas-L 是 型膜蛋白, Fas 與其配體或 抗體結(jié)合均能誘導(dǎo)細胞凋亡。2.4

38、.6細胞因子與骨性關(guān)節(jié)炎細胞因子在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中占重要地位,它可以加速軟骨基質(zhì)的分解代 謝,加重軟骨退變。實 驗 研 究1材料與儀器1.1實驗動物新西蘭大白兔 24只,雌雄各半,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供 (動物 合格證號:00244491.2材料與試劑1.2.1鹿茸多肽及其制備方法鹿茸多肽制劑是從新鮮的梅花鹿茸中提取的,需要在低溫下保存。鹿茸切成 1cm3小塊,蒸餾水沖洗成透明白色,粉碎,膠體磨打成勻漿, pH3. 5醋酸水溶液離心,取 上清,加乙醇沉淀一夜 ,再取上清,回收乙醇,溶液凍干得到粗粉末,加甘露醇制成 凍干粉,每支為 8mg。每支加入 2ml生理鹽水,充分溶解

39、備用 45。1.2.2其他材料與試劑F 12培養(yǎng)液; MTT (Amresco 產(chǎn)品 ; 甲苯胺藍、 1, 9-二甲基亞甲藍、 型膠原酶 (sigma 產(chǎn)品 ;胎牛血清(Hycfone 公司產(chǎn)品 。1.3主要儀器超薄切片機; CO 2培養(yǎng)箱(美國 ; OLYMPUS PM2(日本 ; IBAS-2000圖像分析 系統(tǒng)。2實驗方法2.1建立骨性關(guān)節(jié)炎動物模型選取新西蘭大白兔 24只,雌雄各半,隨機分成 8組,每組 3只。其中兩只做為骨 性關(guān)節(jié)炎模型動物, 1只做假手術(shù)。從第 1周至第 8周,每周為 1組動物做手術(shù)。以水 合氯醛 (10%, lml/kg麻醉動物后,取仰臥位,四肢固定于手術(shù)臺上,備

40、皮,碘伏消毒, 鋪無菌洞巾, 以雙后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)中點為中心, 做橫行切口, 長度約 1cm , 逐層切開皮膚, 筋膜,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶。此時切開兩只骨性關(guān)節(jié)炎模型動物關(guān)節(jié)囊,探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā) 病變后,切斷前交叉韌帶,全部切除內(nèi)側(cè)半月板,逐層縫合切口。而不切斷另外 1只假 手術(shù)動物的前交叉韌帶,也不切除其內(nèi)側(cè)半月板,逐層縫合。術(shù)后每天肌注青霉素 20萬 U ,連續(xù)一周,以預(yù)防感染。造模 1周后,每天人工驅(qū)趕兔子來回行走約 0.5小時。 兩個月后,取第一組實驗動物,耳靜脈空氣栓塞處死實驗動物。手術(shù)截取動物膝關(guān) 節(jié), 觀察動物脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨面變化。 假實驗動物關(guān)節(jié)面完整, 色澤如常 (如圖 1

41、所示 , 而骨性關(guān)節(jié)炎模型動物關(guān)節(jié)面粗糙, 有小的裂隙且色澤灰暗 (如圖 2所示 , 根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨病變評分標準 46:0分:關(guān)節(jié)面完整,色澤如常; 1分:關(guān)節(jié)面粗糙,有 小的裂隙且色澤灰暗; 2分:關(guān)節(jié)面糜爛,軟骨缺損深達軟骨表中層; 3分:關(guān)節(jié)面有 潰瘍形成,缺損深達軟骨深層; 4分:軟骨剝脫,軟骨下骨質(zhì)暴露。模型組動物產(chǎn)生骨 性關(guān)節(jié)炎病變。而假實驗組動物關(guān)節(jié)面完好無損。2.2軟骨細胞提取與培養(yǎng)每周處死一組動物,連續(xù) 8周。手術(shù)提取動物脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨,于無菌 操作臺內(nèi), 將手術(shù)收集的軟骨標本放入 10ml 無菌玻璃平皿, 倒入 D-hanks 液掩蓋標本, 在另一平皿中加入少量 F

42、 12培養(yǎng)液, 用手術(shù)刀將軟骨剪成 1-2mm 3的小塊, 在離心機中以 1000rpm5min 離心。收集全部切碎軟骨,除去 F 12培養(yǎng)液,加入 8ml1透明質(zhì)酸酶,室 溫下作用 5分鐘,除去透明質(zhì)酸酶,另加入 16ml透明質(zhì)酸酶,室溫下作用 10分鐘, 去除透明質(zhì)酸酶,用 F 12培養(yǎng)液清洗兩遍,每次 10ml ,離心 1000rpm5min 。用 1膠原酶 4ml 清洗 5分鐘, 去除清洗液,加入 8ml 膠原酶, 37 培養(yǎng) 30分鐘,離心 600rpm5min , 保留上清至一個無菌離心筒中,加入 20ml 膠原酶, 37 培養(yǎng) 90min 繼續(xù)消化,一直消 化至組織蓬松,呈絮狀,

43、將上清液收集, 1000rpm 離心 8min ,獲得細胞團,棄上清,將 細胞懸浮于 16mlF 12培養(yǎng)液中, 200目過濾至一新無菌離心筒中。 10ul 移液器取細胞懸 液 lul 計數(shù)。按 5104接種于培養(yǎng)瓶中。 37 5%CO 2孵箱中培養(yǎng)。 2-4天, F 12培養(yǎng)液換 液一次。待細胞貼壁后,骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞加入不同濃度的鹿茸多肽進行干預(yù)。分組 情況如下:正常對照組:由假手術(shù)動物分離獲得, 10%IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng);骨性關(guān)節(jié)炎模型組:由造模組動物分離獲得,再分為 4組:(l模型組:10%IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng);(2鹿茸多肽低劑量組:加入 6g/ML鹿茸多肽;(3鹿茸多肽中劑量組:加入

44、 12g/ML鹿茸多肽;(4鹿茸多肽高劑量組:加入 24g/ML鹿茸多肽;臨加藥前,鹿茸多肽用含 10%血清的 IMDM 培養(yǎng)基配制成 1mg/mL的溶液,經(jīng) 0.22m微孔濾膜過濾無菌后,首先稀釋成 24g/ML的藥液,再取部分 24g/ML的藥液 2倍稀 釋得到 12g/ML的藥液,最后取部分 12g/ML的藥液 2倍稀釋得到 6g/ML的藥液。 2.3指標檢測2.3.1 MTT法測定軟骨細胞增殖將各組軟骨細胞按 5104/mL, 0.1mL/孔接種于 96孔板,每組 6個復(fù)孔,接種 60h 后依據(jù)分組分別更換正?；蚝谷锥嚯呐囵B(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng) 48h , MTT 法檢測軟骨細胞增 殖情況

45、。2.3.2 GAG含量檢測將各組軟骨細胞按 3104/mL, 2mL/孔接種于 6孔板,做細胞爬片。接種 60h 后依 據(jù)分組分別更換正常或含鹿茸多肽培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng) 48h ,取出細胞爬片用 4%多聚甲 醛固定,用于甲苯胺藍染色 47鑒定細胞表型。具體染色方法: 切片脫蠟、水化; 入 1%硼砂甲苯胺藍染液染 5分鐘; 1% 鹽酸酒精分色 5S ; 60 烘干; 中性樹膠封固。 光鏡下觀察。2.3.2 型膠原檢測將各組軟骨細胞按 3104/mL, 2mL/孔接種于 6孔板,做細胞爬片。接種 60h 后依 據(jù)分組分別更換正常或含鹿茸多肽培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng) 48h ,取出細胞爬片用 4%多聚甲 醛

46、固定,用于 型膠原免疫組化染色,具體步驟:(1石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化; (2 3%過氧化氫孵育 10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化氫酶的活性; (3 PBST(0.2%Tween浸洗, 5min3次; (4 0.4%胃蛋白酶 37 消化 30分鐘,抗原修復(fù); (5 PBST 浸洗, 5min3次; (6 山羊血清室溫封閉 10min ; (7 傾去血清, 加入一抗 (l:150稀釋 , 4 過夜; (8 PBST 浸洗, 5min3次; (9滴加生物素標記的二抗, 37 孵育 30min ; (10 PBST 浸 洗, 3min3次 (11 辣根酶標記的鏈霉卵白素, 37 孵育 30min ; (12

47、 PBST 浸洗, 3min3次; (13三氨基聯(lián)苯二胺 (DAB顯色, (14自來水沖洗; (15蘇木素復(fù)染,脫水,透 明,封片。光鏡下觀察。3 實驗結(jié)果3.1鹿茸多肽對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響MTT 的檢測結(jié)果顯示各組軟骨細胞增殖速度關(guān)系為:正常對照組軟骨細胞骨增殖速度骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖速度加入鹿 茸多肽的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖速度。 但我們發(fā)現(xiàn)加入鹿茸多肽之后的骨性關(guān)節(jié)炎軟 骨細胞增殖速度與模型對照組相比僅僅是略有加快,而效果并不顯著。因此,根據(jù)本次 實驗結(jié)果來看,鹿茸多肽對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞沒有起到明顯促增殖作用。具體實驗結(jié)果如下:鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響 n=

48、6 Effects of VAP on cell proliferatron in OC n=6Group A570正常對照組0.5400.024 模型組 0.594士 0.040*鹿茸多肽低劑量組(6g/ML 0.604土 0.035鹿茸多肽中劑量組(12g/ML 0.609士 0.043鹿茸多肽高劑量組(24g/ML 0.625士 0.044NOTES :*P 0.05 vs Control 鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響 n=6Effects of VAP on cell proliferatron in OC n=61 Control 2 Model 3 V APs6g/ML

49、4 V APs12g/ML5 V APs24g/MLNOTES :*P 0.05 vs Control3.2甲苯胺藍染色結(jié)果在光鏡下觀察的圖片 (見附圖 3 , 可以清晰的看到, 隨著軟骨細胞外基質(zhì)內(nèi)糖胺多 糖含量的增加,甲苯胺藍的染色會隨之加深。正常對照組軟骨細胞甲苯胺藍染色深染; 模型組軟骨細胞甲苯胺藍染色幾乎失染;經(jīng)過不同濃度的鹿茸多肽處理過的軟骨細胞, 會隨著鹿茸多肽濃度的升高,甲苯胺藍染色依次加深。提示,鹿茸多肽對新增殖軟骨細 胞正常表型維持有明顯促進作用。3.3 型膠原免疫組化染色結(jié)果由下表和附圖 4可見,經(jīng)過不同濃度鹿茸多肽處理后的軟骨細胞, 型膠原免疫組 化染色逐漸加強,模型組

50、軟骨細胞 型膠原免疫組化陽性染色很弱,陽性染色面積大幅 度減少,說明細胞中 型膠原的含量回升。 型膠原是透明軟骨的特征性膠原。根據(jù) 型膠原免疫組化染色的測定結(jié)果,進一步說明了鹿茸多肽對維持軟骨細胞正常膠原分 泌,保持新增殖軟骨細胞正常表型有促進作用。 討 論骨性關(guān)節(jié)炎 (Osteoarthritis,OA是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一,以關(guān)節(jié)軟骨 的退行性變?yōu)橹饕±硖卣?常見癥狀為受累關(guān)節(jié)疼痛,活動受限,休息后緩解晨起有 僵硬感等。骨性關(guān)節(jié)炎嚴重影響老年患者的行走、上下樓梯和其它下肢功能,嚴重者可 造成關(guān)節(jié)殘疾。從中醫(yī)學(xué)角度分析,骨性關(guān)節(jié)炎屬于 “ 痹證 ” 范疇。 素問 長刺節(jié)論指 出

51、:“ 病在骨,骨重不可舉,骨髓酸痛,寒氣至,名曰骨痹 ” ; 張氏醫(yī)通曰:“ 膝為筋 之府 ” 、 “ 膝痛無有不因肝腎虛者 ” 。中醫(yī)認為腎主骨 、肝主筋,人至中年后,肝腎漸虧, 筋骨失養(yǎng),不榮則痛;加之風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲留駐關(guān)節(jié),或跌仆扭傷,導(dǎo)致骨脈瘀滯, 不通則痛。1軟骨細胞1.1軟骨細胞與骨性關(guān)節(jié)炎毫無疑問,軟骨細胞在骨性關(guān)節(jié)炎的病程中扮演著重要的角色,關(guān)節(jié)軟骨不是靜止 的組織, 軟骨細胞具有合成和降解細胞外基質(zhì)成分的功能, 是關(guān)節(jié)軟骨代謝的活性成分。 關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在由軟骨細胞介導(dǎo)的內(nèi)部動態(tài)改建系統(tǒng),在許多因素的參與下,如通過細 胞因子和生長因子的作用,精確調(diào)節(jié)蛋白酶和蛋白酶抑制劑的含量

52、,以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn) 定。軟骨細胞能通過細胞膜上特異受體控制周圍細胞的定位分布,調(diào)節(jié)周圍基質(zhì)成分的 合理分布。在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的過程中,軟骨細胞因多種原因會受到損傷,數(shù)目減少, 并且在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝修復(fù)紊亂的過程中起到了重要的作用。1.2鹿茸多肽促進骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的作用MTT 的檢測結(jié)果顯示:加入 10%血清培養(yǎng)基的模型對照組軟骨細胞增殖速度明顯 高于正常對照組軟骨細胞骨增殖速度, 而加入鹿茸多肽的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖速度 對比模型對照組僅僅是略有加快,而并不顯著。前人的研究表明,鹿茸多肽對促進骨折 愈合有顯著效果,并且也有研究表明在體外實驗中,鹿茸多肽對正常軟骨細胞有明顯的 促增

53、殖作用, 那為什么本次實驗結(jié)果卻表明鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞沒有明顯促 增殖作用呢?經(jīng)過分析,認為可能有兩種原因?qū)е铝诉@個現(xiàn)象的產(chǎn)生:其一,骨性關(guān)節(jié) 炎的軟骨細胞有別于正常軟骨細胞,它本身就處于一種活躍的分裂增殖狀態(tài),因此在實 驗中,鹿茸多肽對于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的促增殖作用被其自身的分裂增殖效果所掩 蓋;其二,有研究結(jié)果表明:在低濃度的血清培養(yǎng)液環(huán)境里,軟骨細胞會發(fā)生嚴重的凋 亡, 使得實驗無法繼續(xù), 因此本實驗的模型對照組和鹿茸多肽組均加入了 10%IMDM培養(yǎng)液, 而培養(yǎng)液中的血清生長因子的作用很可能掩蓋了鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞 的促增殖作用。因此,鹿茸多肽對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞是

54、否有顯著的促增殖作用還有待于 進一步研究。2 鹿茸多肽維持軟骨細胞正常表型的作用骨性關(guān)節(jié)炎病變關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生緩慢、漸進性的退變。引發(fā)該病的初始因素是膝關(guān) 節(jié)生物力學(xué)平衡的改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)應(yīng)力的變化,引起關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝紊亂。由此產(chǎn)生 各種蛋白酶等局部因子,分解軟骨基質(zhì)中的膠質(zhì)和 GAG ,分解代謝大于合成代謝,從 而使軟骨基質(zhì)喪失,甚至軟骨全層消蝕。在關(guān)節(jié)表面、邊緣及軟骨下形成新骨。因此, GAG 在軟骨基質(zhì)的含量多少影響到軟骨細胞的表型,而實驗表明:隨著軟骨細胞內(nèi)糖 胺多糖含量的增加,甲苯胺藍的染色會隨之加深。正常對照組軟骨細胞甲苯胺藍染色深 染;模型組軟骨細胞甲苯胺藍染色幾乎失染;經(jīng)過不同濃度

55、的鹿茸多肽處理過的軟骨細 胞,會隨著鹿茸多肽濃度的升高,軟骨細胞的甲苯胺藍染色依次加深。提示鹿茸多肽能 夠回升骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì)中 GAG 的含量。 型膠原是軟骨細胞分泌的特征性基質(zhì)成分, I 型膠原主要由成纖維細胞分泌,而 型膠原乃由肥大軟骨細胞產(chǎn)生 48。骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時,軟骨細胞出現(xiàn)了表型改變,表 現(xiàn)在軟骨細胞 I 、 X 型膠原表達升高, 型膠原含量減少。所以,盡管骨關(guān)節(jié)炎軟骨細 胞處于增殖分裂的較活躍狀態(tài),但表型的改變,使它們向纖維軟骨細胞或肥大軟骨細胞 分化, 不能形成正常的透明軟骨, 而出現(xiàn)纖維化軟骨、 骨贅這些骨性關(guān)節(jié)炎的典型病灶。 由于損傷因子的不斷刺激,代償性修復(fù)形成

56、異常結(jié)果,加之分解代謝的增強,必然造成 惡性循環(huán),透明軟骨結(jié)構(gòu)逐漸損耗破壞,骨性關(guān)節(jié)炎向中晚期發(fā)展。由此可見,軟骨細 胞修復(fù)紊亂在骨性關(guān)節(jié)炎的病情發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。 如果能夠調(diào)控增殖細胞的 表型,使早期損失的軟骨得到正常修復(fù),就很有可能延緩骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展,甚至使軟 骨恢復(fù)到接近正常的狀態(tài)。實驗中發(fā)現(xiàn),鹿茸多肽能夠在回升骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì) 中 GAG 、 型膠原的含量。因此,鹿茸多肽在維持新增殖軟骨細胞表型中起到正向調(diào) 節(jié)作用。1 建立骨性關(guān)節(jié)炎動物模型,選取新西蘭大白兔 24只,雌雄各半,隨機分成 8組, 每組 3只。其中兩只做為骨性關(guān)節(jié)炎模型動物, 1只做假手術(shù)。從第 1周至第

57、 8周,每 周為 1組動物做手術(shù)。根據(jù)軟骨病變評分標準而知:模型組動物產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎病變, 而假實驗組動物關(guān)節(jié)面完好無損。2 每周處死一組動物,連續(xù) 8周。手術(shù)提取動物脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨,提取 并培養(yǎng)軟骨細胞,待細胞貼壁后,骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞加入不同濃度的鹿茸多肽進行干 預(yù)。3 MTT法測定鹿茸多肽對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的促增殖結(jié)果提示:鹿茸多肽對骨關(guān) 節(jié)炎軟骨細胞沒有顯著促增殖效果,也可能由于某些因此掩蓋了鹿茸多肽的促增殖作 用,因此,有待于進一步研究。4 甲苯胺藍染色結(jié)果得知:鹿茸多肽能夠回升骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì)中 GAG 的 含量。提示:鹿茸多肽在維持新增殖軟骨細胞表型中起到正向調(diào)節(jié)作用。5 由 型膠原免疫組化染色結(jié)果可知:鹿茸多肽能夠回升骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì) 中 型膠原的含量。因此,鹿茸多肽在維持新增殖軟骨細胞表型中起到正向調(diào)節(jié)作用。誠摯的感謝導(dǎo)師趙文海教授幾年來對學(xué)生的教誨之恩, 本論文是在他精心指導(dǎo)下完 成的。導(dǎo)師的一言一行都給學(xué)生今后的人生道路樹立了榜樣;導(dǎo)師淵博的學(xué)識,精益求 精的科研精神都給學(xué)生今后的醫(yī)學(xué)道路指明了方向;導(dǎo)師在做人、工作、