1、時間分辨熒光免疫技術什么是時間分辨熒光免疫分析（TrFIA ）？ TrFIA的標記物及特點。 為什么叫“時間分辨”?TrFIA的檢測原理各種免疫方法學的比較 TrFIA的 臨床應用廠廠 家家l芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研l(wèi)WALLAC和新波公司使用疝燈，主要用于臨床 l鑭系元素共有15種，屬三價元素，應用在時間分辨熒光免疫技術中有四種：l銪(Eu)、釤Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te) Eu3 +的應用最為廣泛， Sm3+ 可作為第二種選擇以進行雙標記或多標記技術 不同的三價稀土離子具有不同發(fā)射光譜和各自不同的熒光壽命等特點，這樣就適合進行雙標記和多標記，從而實

2、現(xiàn)可同時檢測一個樣品中，兩種或兩種以上的抗原或抗體，即一個試劑盒相當與兩個試劑盒或多個試劑盒，這就是我們所說的多標記技術。 l鑭系元素熒光特點：v熒光壽命極長熒光壽命極長l鑭系元素螯合物（60900 us) l普通熒光免疫中熒光團：1100nsl樣本中蛋白質熒光：110ns，易猝滅。vStokes位移大位移大l銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，l熒光素的Stokes位移近280nmv熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615 5nm） 解離-增強技術可使其熒光性提高100萬倍時間分辨時間分辨u生物制品（如蛋白質）本身產生的熒光波長位于400-600nm，所以用

3、普通熒光素來檢測生物樣品時，自然本底的熒光干擾太大。u樣品中蛋白質類的本底熒光衰變時間約為1-10nsuTrFIA技術中，由于鑭系稀土離子螯合物所產生的熒光不僅強度高，而且半壽期也長，介于10-1000us之間，比普通熒光標記物高5-6個數(shù)量級（1000ns=1us)。u含有銪或釤的螯合物的熒光衰變時間分別為730000ns和50000 ns。因此利用延緩測量時間，待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后，再檢測稀土離子螯合物的熒光信號（見圖1）。消除了來自樣品、試劑及其他非特異熒光，從而達到降低自然本底熒光和消除樣品熒光的干擾，大大提高了檢測靈敏讀。這既是我們長提到的時間分辨。 利用鑭系元素熒光

4、物理特性，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光。而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0圖1Stokes位移位移lStokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長差。 例如TRF中銪的激發(fā)光波長340nm,發(fā)射光波長613nm，兩者之間的波長差即Stokes位移為273nm（見圖2），所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分開。l而普通熒光物質的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長差即Stokes位移為28nm，那就很難排除激發(fā)光對發(fā)射光的干擾，影響檢測結果。 發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大StokesStokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾干涉濾光片光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。圖2稀土離子激發(fā)

5、光、發(fā)射光和Stokes位移 稀土離子螯合物 激發(fā)光波長（nm） 發(fā)射光波長（nm） Stokes位移（nm） Eu-螯合物螯合物 340 613 273 Sm-螯合物螯合物 340 600 260 Tb-螯合物螯合物 295 490/543 195/248 Dy-螯合物螯合物 295 573 278 解離增強技術解離增強技術解離增強技術是TRF技術中所特有的指當免疫反應完成后部分標記物結合到固相載體上，未結合的標記物被洗掉。再加入低PH值（PH23）的增強液，把Eu或Sm從免疫復合物中解離下來，與增強液中的螯合物質（-二酮體）結合形成新的螯合物，使標記物產生的熒光強度增強近百萬倍 l用三價稀

6、土離子離子及其螯合物作為示蹤物，代替、和，標記抗原、抗體、核酸探針等物質；l當免疫過程結束后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜熒光光譜的物理特點 （、 、 ），并采用解離-增強技術（ DELFIA）放大有效熒光；最后用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應最后產物的熒光強度。l根據(jù)已知濃度所確定的標準曲線，來判斷未知樣品的濃度值，以達到定量分析的目的。時間分辨熒光免疫時間分辨熒光免疫原理圖原理圖（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）乙肝乙肝“兩對半兩對半” TRFIA定定量檢測原理示意圖量檢測原理示意圖乙肝表面抗原免疫反應圖 （時間分辨熒光法）（時間分辨熒光法）

7、乙肝表面抗體免疫反應圖 （時間分辨熒光法）（時間分辨熒光法）乙肝抗原免疫反應圖 （時間分辨熒光法）（時間分辨熒光法）乙肝抗體免疫反應圖（時間分辨熒光法）（時間分辨熒光法）乙肝核心抗體免疫反應圖 （時間分辨熒光法）（時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫的試劑種類l甲狀腺功能檢測甲狀腺功能檢測TSH，Ultra TSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TGl性激素類檢測性激素類檢測FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBGl腫瘤標記檢測腫瘤標記檢測AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM

8、，CA-50，CA-125，CA-199l遺傳科檢查遺傳科檢查產前篩查： hAFP/ HCG ，PAPPA新生兒篩查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKUl傳染病檢測傳染病檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAbl血液科檢測血液科檢測貧血檢查：Ferritin，Vit B12，F(xiàn)olic acidl科研工具科研工具單標記檢測，雙標記檢測，三標記檢測，四標記檢測時間分辨熒光免疫分析與其它時間分辨熒光免疫分析與其它免疫學方法的比較免疫學方法的比較l酶聯(lián)免疫（精度：10-9 mol/L ）l放射免疫（精度：10-12mol/L ）

9、l化學發(fā)光 （精度：10-15mol/L ）l電化學發(fā)光 （精度：10-17mol/L ）l時間分辨熒光（精度：10-18mol/L ）l生物芯片 （未知） 酶免疫技術酶免疫技術 熒光抗體技術熒光抗體技術 三大標記技術三大標記技術 放射免疫分析放射免疫分析 待測物質濃度與檢測手段待測物質濃度與檢測手段 臨床化學分析臨床化學分析pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic Drugs (藥物濃度)Thyroid Hormone (甲狀腺激素)Fertility Hormone (孕激素)Cancer Markers (腫瘤標記物)Infectious

10、Disease (傳染病)Vitamins (維生素)Serum Proteins (血清蛋白)10-1210-910-610-310-0各種免疫方法學的比較125Il放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻，是一項較為成熟的診斷技術。l夾心法、競爭法的標記原理為以后的檢測技術的發(fā)展奠定了基礎。l放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，已經為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）l125I的半衰期短而導致其試劑有效期短。l標記物125I的穩(wěn)定性差，導致試劑盒批間、批內的變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造成浪費。l操作繁瑣，出報告時間長。l無法保存?zhèn)?/p>

11、用。l酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。l試劑有效期較長。l衍生技術：l熒光酶免疫分析l增強化學發(fā)光酶免疫技術l磁酶免分析l曾經一度被認為是取代放免的檢測手段。l靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和假陽性。l因酶的純度和反應過程容易受環(huán)境因素影響，導致穩(wěn)定性不好?；瘜W發(fā)光物質（魯米諾）化學發(fā)光物質（魯米諾）l單個樣本單個樣本檢測速度快，適合做急診。l靈敏度較高。l自動化程度高。l儀器種類：l拜耳 ACS180 系列l(wèi)雅培 AXSYMl貝克曼 ACCESSl德普 IMMULITE樣品不能重復檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報廢。本底較高，易受環(huán)境物質干擾。儀器故障率較高。標準曲線穩(wěn)定性較差

12、，需多次定標。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高。l80年代末期問世的新型化學發(fā)化學發(fā)光光免疫分析方法。l基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)3和三丙胺在電場觸發(fā)下產生發(fā)光的化學發(fā)光反應。l本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。l儀器檢測速度慢 （羅氏公司）lECL1010 60 測試/小時lECL2010 90 測試/小時l非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。l試劑價格過高。TRFIA在乙肝在乙肝“兩對半兩對半”定量檢測應用定量檢測應用一、提高了檢測的靈敏度 時間分辨熒光法（TRFIA）檢測HBsAg靈敏度可達到0.2ng/ml，而酶免法（ELISA）檢測H

13、BsAg靈敏度是2ng/ml。 縮短了急性乙肝檢測的“窗口期”二、動態(tài)觀察療效和病情檢測 疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預后是個動態(tài)的變化過程，TRFIA定量檢測乙肝“兩對半”各項標志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預后起到動態(tài)檢測的作用，指導醫(yī)生治療。u（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度的變化，可以預見急性乙肝是否處于恢復期 如HBsAg濃度降低，HBsAb逐漸升高，說明病情正向恢復期發(fā)展反之。反之，HBsAg濃度處于高水平或上升，而HBsAb處于低水平，則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。u（2）定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。 1、HBeAg向HBeAb

14、轉換時期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HBeAb濃度升高。 2、高濃度的HBeAg提示病毒處于高復制狀態(tài)，有較強傳染性。 3、高濃度的HBeAb一方面提示病情的好轉，但在有些時候（如肝功能指標很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關。u（3）HBcAb濃度的高低可以反映病毒感染的狀態(tài) 1、乙肝急性感染常為高滴度的HBcAb，恢復期濃度下降，慢性乙肝HBcAb呈持續(xù)高濃度。 2、低濃度的HBcAb一般為恢復期或既往感染。u（4）有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的判斷 非活動性慢性乙肝各項指標相對穩(wěn)定 活動性慢性乙肝往往呈進行性變化三、乙肝疫苗接種 HBsAb是一種真正意義的保護性抗體，其定量的檢測可

15、以對其具有的免疫力做出正確的評價，對乙肝的預防起到監(jiān)督作用。定 量 ELISA（定性）意 義010mIU/ml陰性（-）機體對乙肝病毒無免疫力，易感染乙肝病毒10100mIU/ml陽性（+）機體對乙肝病毒的免疫力很弱，甚至不能預防HBV感染，仍有感染HBV的危險100mIU/ml陽性（+）機體對乙肝病毒有較強的免疫力，使機體有抵抗HBV入侵的作用，較大程度上減少感染HBV的風險 由此可見定量測定對乙肝疫苗免疫力的評估和高危人群預防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預防乙肝方面四、HBV血清學標志物與HBV-DNA的關系n血清學標志物 反映機體對病毒的免疫狀態(tài)，病程，判斷病情， 不能完全反映病毒在體內的復制狀況nHBV-DNA 1、真實反映病毒在體內復制水平，觀察藥物療效 2、部分“小三陽”及低水平病毒復制時出現(xiàn)陰性 3、不能反映機體的免疫狀態(tài)和病情n血清HBV-DNA熒光定量PCR測定可以直接反映病毒的數(shù)量，病毒的復制情況，具有很多臨床應用價值，但不能完全反映病毒復制靜息期肝細胞內HBV病毒的狀態(tài)nHBV-DNA陰性并不完全代表體內HBV已被清除，結合“兩對半”各項指標更能客觀反映體內HBV病毒狀態(tài)，正確的判斷預后和治療時間分辨法檢測時間分辨法檢測“乙肝兩對半乙肝兩對半”的意的意