1、第一節(jié)：氨基酸，第一節(jié)：氨基酸，2.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第二節(jié)：氨基酸的分離分析，第二節(jié)：氨基酸的分離分析，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第三節(jié)：肽和蛋白質(zhì)，第三節(jié)：肽和蛋白質(zhì)，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第四節(jié)：蛋白的分離，第四節(jié)：蛋白的分離，0.5學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)第五節(jié)：一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，第五節(jié)：一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，1學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性 1010-1012結(jié)構(gòu)蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l180180多種天然多種天然AAAA，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的。這些成的。這些AAAA被稱為非蛋白質(zhì)被稱為非蛋白質(zhì)AAAA。l參與蛋白質(zhì)組成的參與蛋白質(zhì)組成的AAAA為為蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)AAAA，常見(jiàn)的

2、常見(jiàn)的只有只有2020種種 基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸l 表達(dá)方式：表達(dá)方式：三字母三字母或或單字母的簡(jiǎn)寫符號(hào)單字母的簡(jiǎn)寫符號(hào)l除脯氨酸外，其他除脯氨酸外，其他1919種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R R基基的不同。的不同。 -氨基酸氨基酸可變部分可變部分不變部分不變部分COOHCHH2NR一、基本氨基酸1, 1, 按按側(cè)鏈側(cè)鏈R R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三類，分為三類l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸15種種C2:1 C3:3 C4:3 C5:4 C6:4l芳香族氨基酸芳香族氨基酸3種種l雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)族氨基酸

3、2種種GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸氨基酸的的R R基大小基大小l分為分為4 4類：類：l非極性氨基酸：非極性氨基酸：9 9l 極性不解離：極性不解離：6 6l極性氨基酸極性氨基酸 解離帶負(fù)電荷：解離帶負(fù)電荷：2 2酸性酸性l 極性解離極性解離l 解離帶正電荷：解離帶正電荷：3 3堿性堿性lPOLARNON-POLARTyrHisGly酸性酸性中性中性BasicAspGluGlnCysAsn SerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的極性分類氨基酸的極性分類極極性或非性或非極極性，是性，是影響影響蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

4、的關(guān)鍵質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵-+SS有大有小有正有負(fù)有極性非極性 形形色色的氨基酸側(cè)基 l含硫氨基酸含硫氨基酸l含羥基氨基酸含羥基氨基酸l-C-C帶分支氨基酸帶分支氨基酸l二羧基一氨基氨基酸二羧基一氨基氨基酸l二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸l亞氨基酸亞氨基酸COOHCHH2NR除甘氨酸外，除甘氨酸外，皆含皆含手性手性C C，皆為，皆為L(zhǎng)-L-構(gòu)型（構(gòu)型（蛋白中的蛋白中的氨氨基酸）；基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測(cè)定。旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測(cè)定。比旋光度比旋光度D D2525( (單位濃度、單位長(zhǎng)度下的旋光度，單位濃度、單位長(zhǎng)度下的旋光度，/c/c* *l)l)是氨基酸的重要物

5、理常數(shù)之一，是鑒別各種是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)氨基酸的重要依據(jù) 。l在近紫外區(qū)在近紫外區(qū)(200-400nm)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能和色氨酸有吸收光的能力。力。l酪氨酸酪氨酸的的 maxmax275nm275nm，l色氨酸色氨酸的的 maxmax280nm280nml苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nml一）氨基酸的兼性離子形式：一）氨基酸的兼性離子形式： 氨基酸的兩個(gè)重要性質(zhì)：氨基酸晶體的氨基酸的兩個(gè)重要性質(zhì)：氨基酸晶體的熔點(diǎn)高（熔點(diǎn)高（ 200200 C C）；氨基酸使水的介電）；氨

6、基酸使水的介電常數(shù)增高。常數(shù)增高。 AA是兩性電解質(zhì)COOHNH2 H+COO-R - C - HNH2 H+R - C - HCOO-NH2R - C - H酸性環(huán)境酸性環(huán)境中性中性環(huán)境環(huán)境堿性環(huán)境堿性環(huán)境+1-10pK1 2pK2 9.4等電點(diǎn)等電點(diǎn)6.0等等電點(diǎn)電點(diǎn)pIpI：所帶凈電荷為零。電場(chǎng)中不移動(dòng)。：所帶凈電荷為零。電場(chǎng)中不移動(dòng)。此此氨基酸氨基酸在在 pH pH 2 2 或或 9 9 附近，有附近，有緩沖緩沖作用作用。賴氨酸的解離及等電點(diǎn)計(jì)算賴氨酸的解離及等電點(diǎn)計(jì)算HA2+A+A0A-l等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point,pI)(isoelectric point,p

7、I)：l中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值：中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值： p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK K-NH2 -NH2 )/2)/2， l l酸性氨基酸：兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值酸性氨基酸：兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK KR-COOR-COO- - )/2 )/2 ， l堿性氨基酸：兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值堿性氨基酸：兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值p pI I = (p = (pK K-NH2-NH2+ p+ pK KR-NH2 R-NH2 )

8、/2 )/2 ， COOHCHH2NR亞硝酸反應(yīng)亞硝酸反應(yīng)烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng)酰化反應(yīng)酰化反應(yīng)脫氨基反應(yīng)脫氨基反應(yīng)西佛堿反應(yīng)西佛堿反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)脫羧基反應(yīng)脫羧基反應(yīng)疊氮反應(yīng)疊氮反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)成成 肽肽 反反 應(yīng)應(yīng)用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。CCCOOO茚三酮茚三酮CCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHOl氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為氨基酸的

9、結(jié)構(gòu)通式為氨基酸。蛋白質(zhì)氨基酸。蛋白質(zhì)除含除含C,H,OC,H,O外，還含有外，還含有N N。AAAA平均分子量平均分子量為為110110。l不同蛋白的含氮量皆在不同蛋白的含氮量皆在16%16%左右。只需測(cè)左右。只需測(cè)定定N N含量，含量， N N含量含量/16%/16%即為蛋白含量。即為蛋白含量。l l - -凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)l根據(jù)根據(jù)R R基的極性。原理：分配層析?；臉O性。原理：分配層析。l 濾紙層析濾紙層析：l 薄層層析薄層層析：l根據(jù)氨基酸的凈電荷及根據(jù)氨基酸的凈電荷及R R基的極性：基的極性：l 離子交換層析離子交換層析：l陰離子交換樹(shù)脂-N(CH3)3OH

10、，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂-SO3Hl根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點(diǎn)大小：根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點(diǎn)大?。簂 電泳電泳：l層析法層析法色層分析法（色譜）色層分析法（色譜）系統(tǒng)的組成固定相（靜相）系統(tǒng)的組成固定相（靜相）流動(dòng)相（動(dòng)相）流動(dòng)相（動(dòng)相）l分配定律分配定律當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的互不相互不相溶溶的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)數(shù). .此比值即分配系數(shù)（此比值即分配系數(shù)（kdkd）。）。l 固定相：固定相：纖維素上吸附的水纖維素上吸附的水流動(dòng)相：展層溶劑，有機(jī)相流動(dòng)相：展層溶劑，有機(jī)相

11、層析時(shí)，混合層析時(shí)，混合AAAA在兩相中不斷分配，在兩相中不斷分配，疏水性強(qiáng)的疏水性強(qiáng)的AAAA在固定相水中溶解度在固定相水中溶解度較較小，與水的作用力也較小，與水的作用力也較小，小，隨展層劑的展層（移動(dòng)）也移動(dòng)較遠(yuǎn)距離隨展層劑的展層（移動(dòng)）也移動(dòng)較遠(yuǎn)距離（遷移率（遷移率RfRf大）。大）。l極性強(qiáng)的極性強(qiáng)的RfRf值小，疏水性強(qiáng)的值小，疏水性強(qiáng)的RfRf大。大。l分離、鑒定分離、鑒定AAAA混合物的方法?；旌衔锏姆椒?。l將下列每組混合物分別用正丁醇將下列每組混合物分別用正丁醇- -醋酸醋酸- -水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對(duì)遷移率。水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對(duì)遷移率。l(1) Val(1) V

12、al和和Lys;Lys;l(2) Phe(2) Phe和和Ser;Ser;l(3) Leu(3) Leu、AlaAla、SerSerl一個(gè)氨基酸的羧基一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的與另一個(gè)氨基酸的氨基之間失水形成氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為的酰胺鍵稱為肽鍵肽鍵，所形成的化合物稱所形成的化合物稱為肽。為肽。由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個(gè)到幾十由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個(gè)氨基酸組個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基氨基酸殘基。CCNCCNCCN

13、CCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽鍵l在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。順序稱為氨基酸順序。l方向性：方向性：一條多肽鏈有兩個(gè)末端，自由 - -氨基，稱為氨基，稱為氨基端或氨基端或N-N-端；端；游離 - -羧基，稱為羧基端或羧基，稱為羧基端或C-C-端。端。l氨基酸的順序：氨基酸的順序：N-N-端端C-C-端端l如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glun 絲氨絲氨酰酰纈氨纈氨

14、酰酰酪氨酪氨酰酰天冬氨天冬氨酰酰谷氨谷氨酸酸肽單位肽單位主鏈：側(cè)鏈 肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)。肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)。肽的酸肽的酸堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端 -NH-NH2 2和游離和游離末端末端 -COOH-COOH以及側(cè)鏈以及側(cè)鏈R R上可解離的基上可解離的基團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點(diǎn)。團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點(diǎn)。末末端端 - -NHNH2,2, - -COOHCOOH比游離氨基酸的比游離氨基酸的酸堿度降低。酸堿度降低。 l在生物體中，多肽最重要的存在形式是在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。作為蛋白質(zhì)的亞單位。l但是，也有許多分子量比較小

15、的多肽以但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。殊的生理功能，常稱為活性肽。l如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；肽；谷胱甘肽谷胱甘肽；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。l部分肽中含有部分肽中含有D-D-氨基酸。氨基酸。l CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCHCH2 2SHSH 1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng) 2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng)作為輔酶參與氧化還原反應(yīng) 保護(hù)巰基酶或含保護(hù)巰基

16、酶或含Cys的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中 SH的還原性的還原性 防止氧化物積累防止氧化物積累GSH+GSH-GSSG根據(jù)：根據(jù)：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離。蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離。 溶解度不同溶解度不同: : 反相柱層析；反相柱層析；鹽析鹽析 分子量不同分子量不同: : 透析；透析；凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 所帶電荷不同所帶電荷不同: : 電泳；離子交換層析電泳；離子交換層析 特有的親和力：特有的親和力：親和層析親和層析l不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，界條件如鹽濃度，pHpH值

17、，溫度等而變。值，溫度等而變。 鹽對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響 鹽溶鹽溶 Salting-in:加少量鹽使蛋白質(zhì)溶解度變大 鹽析鹽析 Salting-out: 加大量鹽使蛋白質(zhì)由溶液中沉淀出來(lái) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解度溶解度和和pH值及鹽濃度有關(guān)值及鹽濃度有關(guān)0.0010.0050.01 0.02 NaCl(mol/L)pI4.8 5.0 5.2 5.4 5.6pH溶解度蛋白的穩(wěn)定因素：蛋白的穩(wěn)定因素：（1 1）帶電層）帶電層（2 2）水化層）水化層加入少量鹽：增加入少量鹽：增加帶電層，促進(jìn)加帶電層，促進(jìn)溶解。溶解。 -鹽溶鹽溶Aggregate蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子表面的疏水性分子表面的疏水性區(qū)域區(qū)域，聚集，聚集

18、許許多水分子，多水分子，當(dāng)當(dāng)加入加入鹽時(shí)鹽時(shí)，這這些水分子被抽出，暴露出些水分子被抽出，暴露出來(lái)來(lái)的疏水的疏水性性區(qū)域區(qū)域互相互相結(jié)合結(jié)合，形成，形成沉淀沉淀。 鹽析鹽析 Salting-out Salting-out ：Ionic strength溶解度+-+-+AmmoniumsulfateSodiumsulfateA little salting-in effectNH4+SO42-= hydrophobic硫酸銨分級(jí)沉淀硫酸銨分級(jí)沉淀l又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，通過(guò)具有通過(guò)具有分子篩性質(zhì)的凝膠分子篩性質(zhì)的凝膠而分離。而分離。l葡聚糖

19、凝膠葡聚糖凝膠G10-G200G10-G200l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2B,4B,6B2B,4B,6Bl聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠S100S100S600S600 凝膠顆粒小分子進(jìn)入凝小分子進(jìn)入凝膠分子內(nèi)，被膠分子內(nèi)，被滯留滯留大分子在凝大分子在凝膠顆粒間移膠顆粒間移動(dòng)，較快流動(dòng)，較快流出出溶劑流動(dòng)方向溶劑流動(dòng)方向按按分分子子量量從從大大到到小小依依次次流流出出l如兩分子間有如兩分子間有專一性親和力專一性親和力（特別的結(jié)（特別的結(jié)合和識(shí)別能力，具有合和識(shí)別能力，具有針對(duì)性針對(duì)性），以其中一種以其中一種作為作為“魚餌魚餌”，可把另外一種，可把另外一種“釣釣”出來(lái)。出來(lái)。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上

20、。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。 親和層析親和層析法的作用法的作用機(jī)理機(jī)理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)的配體XBAAl在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。l蛋白質(zhì)有各自的等電點(diǎn)。在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋蛋白質(zhì)有各自的等電點(diǎn)。在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。l蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（v v）取決于）取決于電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度(E)(E)，所帶的，所帶的凈電荷凈電荷(q)(q)以

21、及與以及與介質(zhì)介質(zhì)的摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)(f(f，即顆粒大小及形狀，即顆粒大小及形狀) )。lSDSSDS（十二烷基（十二烷基磺酸鈉磺酸鈉）是一種陰離子型表）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基按大約基按大約1 1 2 2比例結(jié)合，使比例結(jié)合，使蛋白以一條無(wú)蛋白以一條無(wú)構(gòu)型的長(zhǎng)條分子存在構(gòu)型的長(zhǎng)條分子存在，且分子表面均勻結(jié)，且分子表面均勻結(jié)合一層負(fù)的合一層負(fù)的SDSSDS的電荷，蛋白質(zhì)分子的電荷，蛋白質(zhì)分子原有電原有電荷間的差別則可以忽略荷間的差別則可以忽略。l用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同

22、蛋白質(zhì)的分子量。估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。 定義定義 1969年年，國(guó)際純化學(xué)與，國(guó)際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)（IUPAC） 規(guī)定規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級(jí)：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多蛋白質(zhì)多肽連中肽連中AA的排列的排列順序，包括二硫順序，包括二硫鍵的位置。鍵的位置。F. Sanger (1953, Cambridge U) Insulin 胰島素 (A, B chains)以傳統(tǒng)氨基酸定序法決定蛋白質(zhì)序列S SSSS S+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSI C SLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-ch

23、ainl（1） 測(cè)定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，測(cè)定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，分析分析多肽鏈的多肽鏈的N末端和末端和C末端殘基末端殘基l（2）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵l（3） 測(cè)定每條多肽鏈的測(cè)定每條多肽鏈的AA組成組成l（4） 多肽鏈斷裂成小肽段多肽鏈斷裂成小肽段 （5） 測(cè)定各個(gè)肽段的測(cè)定各個(gè)肽段的AA順序順序 l（6） 確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序（7） 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈夠與肽鏈N-N-端的游離氨基作

24、用，生成二硝基苯端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（衍生物（DNP-DNP-肽）。肽）。l酸解，得黃色酸解，得黃色DNP-DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。（一）一）N N末端分析法末端分析法O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個(gè)反應(yīng)是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個(gè)反應(yīng)用途用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨

25、基酸末端氨基酸.DNSDNS + + AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白弱堿弱堿DNS-DNS-AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白酸酸DNS-AADNS-AA + +游離游離AAAA（乙醚抽提，有熒光）（乙醚抽提，有熒光）l在可用在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍（使鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開(kāi)）存在下，蛋白變性，亞基分開(kāi)）存在下，使使用過(guò)用過(guò)量的量的 - -巰基乙醇巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，使二硫鍵還原為巰基，然后用然后用烷基化試劑烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。(三三)氨基氨基酸組成的酸組成的分析：分析：酸，

26、堿解后酸，堿解后氨基酸分析氨基酸分析儀測(cè)定儀測(cè)定l1 1、 酶裂解法酶裂解法 胰胰蛋白酶蛋白酶蛋白水解酶（蛋白酶）：蛋白水解酶（蛋白酶）： 糜糜蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）嗜嗜熱菌蛋白酶熱菌蛋白酶胃胃蛋白酶蛋白酶l胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin ：R R1 1= =賴氨酸賴氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。l胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性胰蛋白酶胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性胰蛋白酶斷裂斷裂Phe,Trp,TyrPhe,Trp,Tyr等芳香族等芳香族AAAA的羧基形成的肽鍵。的羧基形成的肽鍵。NHCHCOR4NHCHC

27、OR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)2、化學(xué)試劑法：溴化氰。R1=R1=甲硫氨酸。l1 1、EdmanEdman化學(xué)降解法化學(xué)降解法lEdmanEdman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種析法實(shí)際上也是一種N-N-端分析法端分析法。此法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 用途用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨末端氨基酸?；帷Ｒ喾Q亦稱EdmanEdman反應(yīng)反應(yīng)弱堿弱堿 AAAAPITC+ PITC+ 多肽多肽 蛋白蛋白 AAAAPTCPTC多肽多肽 蛋白蛋白無(wú)水甲酸無(wú)水甲酸或或HFHFPTH-AA + PTH-AA + 少一個(gè)少一個(gè)AAAA的多肽或蛋白的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）（乙酸乙酯抽提）此反應(yīng)可循環(huán)進(jìn)行此反應(yīng)可循環(huán)進(jìn)行 進(jìn)行進(jìn)行n n