1、復制翻譯 蛋白質（病毒） RNA（病毒）逆轉錄轉錄RNA翻譯蛋白質DNA復制中心法則（The central dogma）DNA的生物合成(復制)DNA Biosynthesis，Replication 第 12 章復制(replication)指遺傳物質的傳代，以親代DNA為模板，dNTP (dATP dGTP dCTP dTTP)為原料，按堿基配對規(guī)律合成子代DNA的過程。復制親代DNA子代DNA問題：1. 在復制過程中DNA雙螺旋如何解旋將雙鏈打開？ 2. 在復制過程中DNA的兩條鏈是否同時作為模板復制子鏈？復制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication 第一

2、節(jié)一、半保留復制 (semi-conservative replication)子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 密度梯度實驗 DNA半保留復制模型 按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。 半保留復制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但不是絕對的。原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉(replication fork) 。 二、雙向復制 (bidirectional replication)復制中的放射自顯影圖像A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B. 復制中的兩

3、個復制叉C. 復制接近終止點(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori535533553復制子(replicon)3三、復制的半不連續(xù)性 (semi-discontinuous replication) 353535解鏈方向領頭鏈(leading strand)隨從鏈(lagging strand)3535 半不連續(xù)性 復制過程中，領頭鏈連續(xù)復制，而隨從鏈不連續(xù)復制的現(xiàn)象。 岡崎片段(okazaki fragment) 不連續(xù)復制的片段 DNA復制的酶學和拓撲學變化The Enzymology and Topology of DNA Replicat

4、ion第二節(jié) 參與DNA復制的物質 模板(template) : 解開成單鏈的DNA母鏈底物(substrate): dNTP DNA聚合酶(polymerase): 簡寫為 DNA-polRNA引物(primer): 提供3-OH使dNTP聚合其他的酶和蛋白質因子一、復制的化學反應 目 錄磷酸二酯鍵的生成N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNA pol聚合反應的特點：聚合 新鏈的延長只可沿53方向進行。 DNA新鏈生成需引物和模板；全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase, DDDP)簡稱：DNA-pol活性：1. 53 聚合

5、活性 2. 核酸外切酶活性二、DNA聚合酶DNA-pol 的 53聚合作用35 5335DNA-pol15/625 3 OHP35外切5 3外切53內(nèi)切酶(Endonuclease)（限制性內(nèi)切酶）5335外切5 3外切(Exonuclease)外切酶與內(nèi)切酶作用圖解16/621. 原核生物的DNA聚合酶共同點：1. 53 的聚合活性 2. 35 外切酶活性DNA-polDNA-pol DNA-pol 功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和 修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-pol （109kD）DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能切除引物，切除突變片段5317/62DNA-pol I

6、35外切酶活性的功能校讀（proofread）功能53AG17/62323個氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604個氨基酸DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性N 端C 端枯草桿菌蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依 然能存活。 它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。 功能: 是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)DNA-po l 同時合成領頭鏈和隨從鏈 段2. 真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物

7、酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。僅存在于線粒體DNA復制中。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 三、復制的保真性 (fidelity) 1. 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律 ATGC2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能 DNA pol 靠其大分子結構協(xié)調非共價(氫鍵)與共價鍵(磷酸二酯鍵) 的有序形成。 嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對時，嘌呤應處于反式構型。 DNA pol III 在催化磷酸二酯鍵形成之前完 成對堿基的選擇；對反式嘌呤核苷酸的親和 力較順式的大。3.

8、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol 的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。解鏈酶類：解螺旋酶拓撲異構酶單鏈DNA結合蛋白四、復制中的解鏈和DNA分子拓撲學變化 引物酶1. 解螺旋酶 (helicase)作用：斷裂互補堿基間的氫鍵，使DNA成單鏈。DnaA、B (rep蛋白、解螺旋酶)、C等解螺旋酶ATP2. 單鏈DNA結合蛋白(single stranded DNA-binding protein, SSB) 作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止 單鏈DNA被核酸酶水解。3. 引物酶 (primase)

9、 55催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶。DNA合成需在RNA引物的基礎上進行。RNA引物53534. DNA拓撲異構酶 (topoisomerase, Topo) DNA正超螺旋與負超螺旋負超螺旋正超螺旋DNA雙螺旋拓撲異構酶10 8 局部解鏈后解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 拓撲異構酶作用特點既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵 拓撲異構酶 拓撲異構酶 分 類切割DNA雙鏈，此時不需ATP；爾后由ATP供能，使DNA分子成負超螺旋再連接切口。不需ATP，切割雙鏈DNA中的一鏈，使DNA松弛后, 連接切口。Topo:Topo: 臨床上使用的某些抗腫瘤藥（如

10、喜樹堿，鬼臼乙叉甙等）是通過抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細胞的。 作用機制 五、DNA連接酶 (DNA ligase) 作用方式 催化DNA雙鏈的3羥基和相鄰的5磷酸基團形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。DNA連接酶ATPATPHO5335DNA連接酶ATPAMP+PPi5353目 錄 在復制中起最后接合缺口的作用； 在DNA修復、重組及剪接中起縫合缺口作用； 基因工程的重要工具酶之一。 功能 參與DNA復制的主要成員主要成員主要作用DnaADnaB (解螺旋酶)SSBDnaG (引物酶)TOPODNA-pol DNA-polDNA連接酶DnaC 識別復制起始位點 解開DN

11、A雙鏈 運送和協(xié)同DnaB 合成RNA引物 維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定 使打結、纏繞、正超螺旋的DNA松馳 DNA復制 水解引物、填補空隙、修復作用 催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接DNA生物合成過程The Process of DNA Replication第三節(jié)復制的起始復制的延長復制的終止（一）復制的起始 (initiation )需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成 由特定蛋白質識別復制起始位點(ori)，在解螺旋酶、TOPO酶及單鏈DNA結合蛋白的共同作用下，DNA解鏈，解旋，形成復制叉。倒Y1. DNA解鏈

12、E.coli復制起始點 oriC E.coli復制起始點oriC跨度為245bp，有3組串聯(lián)重復序列和2對反向重復序列。E.coli復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列 反向重復序列5353 Dna A Dna B、 Dna CSSB3535復制叉的形成5335引物酶DnaC引發(fā)體解螺旋酶含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復

13、合結構稱為引發(fā)體。 2. 引發(fā)體的生成3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3 HO5引物酶DNA拓撲異構酶3. RNA引物合成（二）復制的延長 (elongation)復制的延長指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。 3AAGACCTATT55TTCTGGATAA3dATP+DNA pol 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol領頭鏈的合成隨從鏈的合成階段一階段二階段三階段四1. 原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的 匯合點就是復制的終止點。o

14、riter8232（三）復制的終止2. 領頭鏈上的RNA引物被RNA酶水解后， 由DNA pol I 催化，由新合成鏈提供 3-OH補齊。原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復制的終止過程： 切除引物、填補空缺、連接切口555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶3. 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接真核生物每個染色體是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活。 復制的起始需要DNA-pol和pol參與。還需拓撲酶和復制因子 (repli

15、cation factor, RF)。 增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。（一）復制的起始二、真核生物的DNA生物合成 領頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈引物核小體（二）復制的延長 染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。 復制中岡崎片段的連接，復制子之間的 連接。 染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA 引物，去除后留下空隙。（三）復制的終止53355335+53333555染色體復制危機反轉錄和其他的復制方式Reverse Transcription and Other DNA Replicati

16、on Ways第四節(jié)反轉錄酶 (reverse transcriptase) 反轉錄 (reverse transcription)現(xiàn)象RNADNA 逆轉錄酶一、反轉錄病毒和反轉錄酶 又稱為逆轉錄酶，為依賴RNA的DNA聚合酶，(RNA-dependent DNA polymerase, RDDP)反轉錄酶是多功能酶，有三種酶活性：1. 反轉錄活性：即以RNA為模板合成DNA2. RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA3. DNA pol活性：以DNA為模板合成DNA反轉錄病毒細胞內(nèi)的逆轉錄過程RNA 模板反轉錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA反轉錄酶雙鏈DNA反轉錄酶 A

17、AA A T T T TAAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T分子生物學研究可應用反轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。 以mRNA為模板，經(jīng)反轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。 試管內(nèi)合成cDNAcDNA complementary DNA二、反轉錄研究的意義 反轉錄酶和反轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 反轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對反轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。 端粒帽 染色體 端粒帽端粒帽端粒DNA端粒結合蛋白三、端粒酶 端粒(telomere)指真核

18、生物染色體線性DNA分子末端的結構 對外: 抵御核酸酶等外界 因素的襲擊保護染色體結構和功能的完整性染色體對內(nèi): 染色體DNA的末端復制問題功能 維持染色體的穩(wěn)定性 維持DNA復制的完整性 結構特點 由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。 末端DNA序列是多次重復的富含T、G 堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG 功能 維持染色體的穩(wěn)定性 維持DNA復制的完整性The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009Elizabeth H. Blackburn 1/3 of the prizeUniversity of California San F

19、rancisco, CA, USA 1948 (in Hobart, Tasmania, Australia) Carol W. GreiderJohns Hopkins University School of Medicine Baltimore, MD, USA Harvard Medical School; Massachusetts General Hospital Boston, MA, USA; Howard Hughes Medical Institute 1961 - for the discovery of how chromosomes are protected by

20、telomeres and the enzyme telomeraseJack W. Szostak 1/3 of the prize1/3 of the prize 1952 (in London, United Kingdom) 端粒酶 (telomerase)端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶反轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成: 作用： 填補子鏈5 -末端引物水解后留下的

21、空隙，防 止DNA縮短。端粒酶催化作用的爬行模型 正常細胞：細胞分裂細胞分裂 衰老死亡 細胞年輕化 端粒酶 重新引入抗衰老端粒、端粒酶與細胞衰老 約85%的腫瘤組織有端粒酶活性; 癌細胞在某些機制的作用下啟動端粒酶表達而使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長度; 從而使癌細胞得以持續(xù)增殖、轉移并獲得永生。 端粒、端粒酶與腫瘤DNA損傷（突變）與修復DNA Damage (Mutation) and Repair第五節(jié)遺傳物質的結構改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變 (mutation)。在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷 (DNA damage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。 一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎二、引發(fā)突變的因素 物理因素: 紫外線 (ultra violet, UV)、各種輻射 UV化學因素三、突變的分子改變類型錯配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement)框移(frame-shift) DNA分子上的堿基錯配又稱點突變 (point mutation)發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。轉換發(fā)生在異型堿基之