1、NF-B圈套核苷酸-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備及評價胡娟，羅艷（400016重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科）摘要 目的 制備NF-B圈套核苷酸（decoy ODNs）-聚氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）納米粒（NF-B decoy ODNs-PBCA-NP）。方法 用DEAE-Dextran作為穩(wěn)定劑，通過乳液聚合法制備帶正電荷的PBCA-NP運載NF-B decoy ODNs，檢測其形態(tài)、粒徑、負載率、物理穩(wěn)定性及細胞毒性。結果 制備的納米粒大小均勻，空白納米粒平均粒徑為70 nm，zeta電位為+21.6 mV，負載率為97.49，復合納米粒平均粒徑為150 nm，在150 ng/l

2、以下濃度幾乎觀察不到細胞毒性。結論 該方法制備了負載率高、大小均勻的、細胞毒性小的NF-B decoy ODNs-PBCA納米粒。關鍵詞 NF -B圈套；聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒；乳液聚合法中圖法分類號 R318 文獻標識碼 A _基金項目國家自然科學基金（30271267）通信作者羅艷，電話：(023)89012211，E-mail：核因子-B（NF-B）是一種細胞轉錄因子，它與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關1，被認為是這些疾病的新型治療靶點。NF-B圈套策略（NF-B decoy strategy)是采用人工合成的高親合力寡核苷酸(oligonucleotide，ODNs)作為圈套來轉染細胞

3、，競爭結合轉錄因子，從而抑制內源性基因表達2，3。但ODNs細胞膜通透性差，進入細胞內的量少，且易被核酸酶降解。本研究以氰基丙烯酸正丁酯(BCA)為原料，陽離子復合物二乙胺基乙基（diethylaminoethyl） -葡聚糖（DEAE- dextran）做穩(wěn)定劑，用乳液聚合法制備了PBCA-NP，以decoy ODNs為模型基因制備出核因子-B圈套核苷酸-聚氰基丙烯酸正丁酯-納米粒(NF-B decoy ODNs -PBCA-NP)，研究其負載率、耐酶解能力、細胞毒性及轉染細胞的能力，希望為基因治療和基因調控提供新的手段。1 材料與方法 11 主要材料 BCA(浙江金鵬化工股份有限公司)，D

4、EAE-Dextran500000(Sigma公司)，Dextran6000(Sigma公司)， Zetasizer4700(英國馬爾文公司)，熒光顯微鏡（日本Olympus），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad），透射電子顯微鏡HITACHI-600（日本日立）。12 NF-B decoy ODNs的合成 NF-B decoy ODNs單鏈（上海生工生物工程技術服務有限公司）序列為：5-pCGGAAAGTCCCTTTTTTTTAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCTTTTTTTGGAAAGTCCCCAG-3。將ODN單鏈溶解于SSC溶液中，經過退火、復性得到decoy ODNs

5、。 13 DEAE-PBCA納米粒的制備 取30ml蒸餾水，用HCl調節(jié)至pH為2，將DEAE-dextran0.12g、Dextran0.18g加入，待溶解后，將0.3gBCA單體緩慢加入，用NaOH調節(jié)H值至6，再攪拌1 h即可。14 NF-B decoy ODNs-DEAE-PBCA復合納米粒制備 將ODNs與NP分別溶解在等體積的培養(yǎng)液中，再將兩者充分混合，室溫靜置30 min即可。15 納米粒的形態(tài)學觀察及電位測定將制成的納米粒取少量稀釋，滴至銅網(wǎng)上，鎢酸染色后在透射電鏡下觀察；另取少量加雙蒸水稀釋后用納米粒度儀測定電位。16 負載率測定制得的納米粒離心后取上清液稀釋，用紫外分光光度

6、計測量光密度值。附：負載率=(C0-C)/ C0100% (C0為投入ONDs量，C為上清液中的ODNs量) 17 物理穩(wěn)定性及體外耐酶解實驗1.7.1物理穩(wěn)定性考察 將PBCA-NP懸液密封，一段時間后觀察。另取NP分別加入不同介質中，觀察是否出現(xiàn)凝集。1.7.2體外耐酶解實驗 將復合納米粒加入磷酸二酯酶溶液中，同時以不含NP的decoy ODNs作為對照，于700 r/min分別振蕩1、4、8、16 h后各管加入NaOH，放置12 h后進行凝膠電泳分析。18 細胞毒性實驗 接種腦微血管內皮細胞數(shù)為1104 /孔，于5%CO2，37孵箱中培養(yǎng)24 h，用PBS沖洗細胞2次。加入培養(yǎng)液及不同濃

7、度的納米粒（每組3個復孔，并設空白對照），培養(yǎng)6 h后棄上清液，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，用MTT法檢測細胞活性。19 體外細胞轉染實驗 接種腦微血管內皮細胞數(shù)為5104/孔，培養(yǎng)24h后用PBS沖洗2次。將PBCA-NPs同熒光標記的decoy ODNs、Tween80混勻；往各培養(yǎng)孔加入配置好的復合物，分別在30 min、6 h、12 h、24 h收集長有細胞的玻片，熒光顯微鏡檢測。2 結果21 納米粒形態(tài)及zeta電位PBCA-NP和載decoy ODNs的NP呈表面圓形（圖1、2），大小較均勻，粒子包封完整；經測量空白納米粒的粒徑為70 nm，復合納米粒的粒徑為150nm。納米粒度儀測得

8、PBCA-NP zeta電位為21.6 mV，說明該納米粒表面帶有正電荷。 圖1空白NP透射電鏡觀察 圖2復合NP透射電鏡觀察（50 000） （100 000）22 負載率測定當反應pH值為2和7時，納米粒的負載率較高；因細胞生存條件接近中性，故將后續(xù)反應pH值定為7；而decoy/PBCA質量比為1:10，納米粒負載率較高，達97.49。23 納米粒的物理穩(wěn)定性及體外耐酶解實驗2.3.1 物理穩(wěn)定性考察 PBCA-NP放置加入各種介質之后，我們觀察到：加入PBS緩沖液及Tris-HCl緩沖液的納米粒發(fā)生了顯著的凝集；加入DMEM培養(yǎng)液的納米粒有輕微凝集；加入含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)液及生

9、理鹽水的納米粒未見凝集。封存的納米粒放置3個月后，瓶底有少許沉淀，水浴超聲后顆粒能重新分散，粒徑無明顯變化。2.3.2體外耐酶解實驗 凝膠電泳顯示PBCA-NP結合的decoy ODNs即使被磷酸二酯酶消化了16 h仍能保持結構的完整，而裸decoy ODNs在同樣條件下1 h已被降解。24 納米粒的細胞毒性我們以不同濃度發(fā)納米粒轉染細胞，通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，只有在150 ng/l的較高濃度才觀察到細胞毒性。25 體外細胞轉染實驗制得的納米粒能有效的轉染腦微血管內皮細胞。0.5 h后在細胞內即可觀察到綠色熒光，隨著轉染時間增加，熒光逐漸增多，68 h達到高峰。熒光信號開始主要分布在細胞外及細

10、胞漿內，隨后逐漸進入細胞核內。圖3 熒光標記的ODNs轉染入內皮細胞6 h(熒光顯微鏡)3 討論近年來，非病毒納米載體以其轉染效率高、安全低毒、無免疫原性的特點引起越來越多的關注。本研究選用的PBCA納米粒對細胞無毒性、可提高細胞對寡核苷酸攝入率4,且經表面活性劑修飾后可攜帶藥物透過血腦屏障5，可作為許多藥物的腦靶向載體6，7。由于ODNs與PBCA均具有陰離子特性，二者之間難以吸附，故需加入陽離子復合物形成帶正電荷的納米粒，以促進兩者結合。制備陽離子納米粒時常用的陽離子聚合物有CTAB和DEAE-dextran，但體外實驗發(fā)現(xiàn)，DEAE-dextran所修飾的載ODNs納米粒的穩(wěn)定性優(yōu)于CT

11、AB所修飾的ODNs納米粒8。DEAE-dextran以鑲嵌、吸附等方式在納米粒的表面形成一個有層次的吸附網(wǎng)，通過自身的陽離子吸附上帶陰離子的ODNs，提高納米粒的負載率。通過實驗我們再次證實了PBCA-NP作為基因載體的優(yōu)勢：制備工藝安全、低廉、反應條件溫和、對環(huán)境友好；制得的納米粒大小均勻，負載率高，能保護ODNs免受核酸酶的降解。在基因治療方面，展示出了廣闊而誘人的前景。參考文獻：1 Isomura I，Morita ARegulation of NFkappa B signaling by decoy oligodeoxynucleotidesJMicrobial Immunol，20

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