1、電子顯微術(shù) 圖1日立H-7500，H-7600 圖JEM-2100F日本電子1圖4Sirion場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 2一、 電子顯微鏡的發(fā)展史1、光學(xué)顯微鏡的極限 光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)大約是可見波長(zhǎng)的一半，可見波長(zhǎng)為400-800nm，所以光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)大約是0.2um。2、 1924年，法國(guó)科學(xué)家德.布羅意證明了任何一種快速運(yùn)動(dòng)的粒子，都具有波動(dòng)性。 1926年德國(guó)科學(xué)家布許發(fā)現(xiàn)，高速運(yùn)動(dòng)的電子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)下，會(huì)發(fā)生折射，并且能被聚焦。高速運(yùn)動(dòng)的電子具有波動(dòng)性和折射性是電子顯微鏡的基礎(chǔ)。 20世紀(jì)30年代，經(jīng)過魯斯卡、克諾爾、馬頓等科學(xué)家的不懈努力，終于在1938年試制成功第一臺(tái)實(shí)用電

2、子顯微鏡。3世紀(jì)年代電子顯微鏡問世，年代電鏡技術(shù)和生物樣本制備技術(shù)獲得進(jìn)展。后發(fā)展了掃描電鏡術(shù)、冷凍復(fù)型術(shù)、高壓電鏡術(shù)、線顯微分析術(shù)、掃描隧道顯微術(shù)和原子力顯微術(shù)等。4二、電鏡的應(yīng)用：正常結(jié)構(gòu)；病理診斷；病原；化學(xué)；考古。 5第一節(jié)、透射電子顯微術(shù)一、 透射電鏡的原理1 高速運(yùn)動(dòng)的并具有波動(dòng)性和折射性的電子2 電鏡的各種像差1）球差：是由于透鏡不能把所有的入射光線聚集共同的焦點(diǎn)而產(chǎn)生的。2）像散：這一缺陷主要是由于電子透鏡實(shí)際上不可能做得完全對(duì)稱。3） 色差：可見光的波長(zhǎng)不同。4）畸變:在低倍鏡時(shí)經(jīng)常發(fā)生.因?yàn)閳D像中心部分和周邊部分的放大倍數(shù)不同.6二、透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu) 1 電子槍2 聚光

3、鏡系統(tǒng) 3 樣品室4 成象系統(tǒng):物鏡、第一中間鏡、第二中間鏡、投影鏡。5 觀察和記錄系統(tǒng)7三、透射電鏡的使用1 加速電壓的選擇：40-100kV可以一檔一檔的調(diào)節(jié)。加速電壓對(duì)電鏡的性能有以下的影響：一般樣品薄時(shí)40-60KV，一般樣品60-80KV，厚時(shí)100KV。1） 電壓越高，電子穿透能力越強(qiáng)；2）對(duì)于某些生物制品，電壓越高，圖象反差越??；3）電壓升高電子槍亮度增加，熒光屏亮度也增加；4）電壓升高對(duì)提高分辨率有利。82 聚光鏡光闌和物鏡光闌的選擇 聚光鏡光闌：200-300um;物鏡光闌：20-70um.3 放大倍數(shù)的選擇 選擇放大倍數(shù)的兩個(gè)原則：感興趣的區(qū)域充滿整個(gè)照相底片；感興趣的細(xì)節(jié)

4、特征十分容易測(cè)到。94選視野、調(diào)焦和拍照（1）把要拍照的視野移至屏中心69黑框內(nèi)。（2）用OB FOCUS調(diào)焦，拍照前使OB置于稍欠焦位置上以增加反差。（3）核對(duì)是否存有像散，核對(duì)光斑是否居中，核對(duì)燈絲是否飽和對(duì)稱。（4）根據(jù)事先已在計(jì)算機(jī)上設(shè)定好的最佳光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)BRIGHTNESS，使PAG1上的 EXP TIME為設(shè)定值（參考第三章）。（5）蓋上觀察窗，按下PHOTO，即自動(dòng)曝光。10透射電子顯微鏡生物制品制備技術(shù) 1112The photo of light microscope1314冷凍蝕刻法超薄切片15冰凍蝕刻復(fù)型術(shù) 冰凍割斷術(shù)Freeze etch replica Freeze

5、 cracking16電鏡細(xì)胞化學(xué)術(shù)electron microscope cytochemistry 17免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫電鏡術(shù) Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy 18電鏡放射自顯影術(shù) 顯微放射自顯影技術(shù)Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography19掃描電鏡技術(shù) Scanning electron microscopy SEM被吞噬的紅細(xì)胞20現(xiàn)有的透射電鏡生物制品制備技術(shù)分為兩類：一類是透射電鏡的基本制備技術(shù)，包括超薄切片和負(fù)染色法；另一類是生物制品的特殊技術(shù)

6、，其中包括冷凍蝕刻法、冰凍割斷術(shù)、電鏡細(xì)胞化學(xué)術(shù)、免疫電鏡術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、X線微區(qū)分析技術(shù)等。 211、 超薄切片樣品的制備（1） 取材( 基本要求是在活體情況下進(jìn)行)取材的原則(快、準(zhǔn)、輕、小、冷的原則）1） 快速：1分鐘之內(nèi)投入固定液。2） 塊?。?.5-1mm3或截面1mm2的長(zhǎng)條。3） 部位準(zhǔn)4） 損傷?。浩餍祽?yīng)銳利，避免牽拉、擠壓，防止組織受機(jī)械損傷。5） 低溫：0-4oC22取材的方法1）動(dòng)物材料： 對(duì)神經(jīng)組織等要進(jìn)行原位固定或灌注固定，待組織適當(dāng)硬化后再取材。23胚胎干細(xì)胞的研究242）培養(yǎng)細(xì)胞(Cell culture)： 生長(zhǎng)在瓶中的細(xì)胞到足夠的量，先倒去培養(yǎng)液，然后

7、倒入適量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分鐘、彎頭吸管吹打或用軟器械輕輕地刮下貼壁的細(xì)胞，將這種混合液倒入離心管中，2000rpm低速離心15-20分鐘，使細(xì)胞呈團(tuán)，棄去上清液，換一次固定液，將其移入修塊臺(tái)，修快成標(biāo)準(zhǔn)塊4oC固定、待用。253）單細(xì)胞懸液：精子、血球等其他不易聚集的懸浮游離材料，可加入等量的戊二醛和其他類型的固定液，輕輕地把他們懸浮在固定液中。經(jīng)過固定處理后再離心成團(tuán)，在50oC中棄去上清液，加入適量的經(jīng)50oC預(yù)溫的2%的瓊漿，使團(tuán)懸浮，將懸浮團(tuán)和瓊脂液一同在薄片上展層，固定后切成1mm3的小塊。26（2）固定 (fixation) The aim is to avoid d

8、igestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical structure, pieces of organs should be promptly and adequately treated before or as soon as possible after removal from the animals body.271）Function of fixationA阻止細(xì)胞自溶。B 穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分。C 在一些組分的分子之間以化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)建立鉸鏈，提供一個(gè)骨架來(lái)穩(wěn)定各種細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)。D能

9、提供一定的電子反差 28 理想的固定劑，應(yīng)具備以下條件：能迅速而均勻地滲入組織細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)各種成分；能即刻將細(xì)胞“殺死”，盡可能保持細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，減少死后變化；對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用，不產(chǎn)生人工假象及變形；可保存酶的活性，以利于細(xì)胞化學(xué)測(cè)定工作的進(jìn)行。292）影響固定效果的因素固定液的pH值滲透壓緩沖液的類型固定的溫度和時(shí)間當(dāng)前采用的是在04下固定1 4小時(shí)。303）常用的幾種固定劑A 四氧化鋨（osmium tetroxide,OsO4）亦稱鋨酸：鋨酸實(shí)際上不是酸，它的水溶液是中性的，為一種強(qiáng)氧化劑。0.5-1g包裝，淡黃色晶體。具有揮發(fā)性和毒性，在室溫下易揮發(fā)，其蒸氣對(duì)粘膜有刺

10、激作用，在通風(fēng)櫥內(nèi)配制。31優(yōu)點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白、核蛋白固定較好； 對(duì)脂類固定較好。分子密度高，產(chǎn)生良好的反差，因此鋨酸固定本身也起到生物染色作用。缺點(diǎn)不能固定糖元和核酸，對(duì)微管固定較差。擴(kuò)散慢，穿透能力差。具有揮發(fā)性和粘膜毒性。不適于進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)工作。32B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 特點(diǎn)：純的容易聚合，目前使用25%水溶液進(jìn)口分裝。存放時(shí)間久了容易變質(zhì)，影響固定。 優(yōu)點(diǎn) (1)對(duì)組織穿透力強(qiáng)。(2)能保存某些酶的活性，對(duì)糖元、細(xì)胞膜、核基質(zhì)等有較好的作用。(3)而且組織塊在溶液中可保存較長(zhǎng)的時(shí)間，適用于進(jìn)行超微細(xì)胞化學(xué)研究。 33C 甲醛（fomaldehyd

11、e）:多用多聚甲醛粉劑配制。其分子小，滲透力強(qiáng)，固定迅速，對(duì)酶的活性保存好。 344）固定的方法A 單固定法：?jiǎn)渭?xì)胞或固定液易于浸透的組織 1-2%四氧化鋨（1-2h）。B 雙固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-鋨酸（1% 4oC 2h）。C 原位固定和灌注固定：35附 幾種常見固定劑的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,對(duì)含水較多的組織可用PH值8.0，細(xì)菌、病毒可用PH值在7.0以下。0. 2mol/L磷酸緩沖液的配制 磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水 加到500ml 調(diào)PH到7.436

12、0.2mol/L二甲坤酸鹽酸緩沖液重蒸水 25ml二甲坤酸鈉（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g0. 1mol/L鹽酸 8ml重蒸水 加至50ml調(diào)PH到7.4 37B 固定液的配制鋨酸固定液的配制2%的鋨酸固定液的配制：清洗烘干器皿 1G鋨酸+50ml雙蒸水（棕色瓶）數(shù)日可用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或二甲坤酸鹽緩沖液配制的1%鋨酸固定液。 2%的鋨酸緩沖液 10ml 0.2mol/L緩沖液 10ml 調(diào)節(jié)PH應(yīng)為7.3-7.438戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6重蒸水（ml） 4.6 4 3.40.2ml/L緩沖液（ml） 5 5 5戊二醛最終濃

13、度 1 2.5 4調(diào)節(jié)固定液PH值到7.3-7.439思考題1、要顯示腦組織的膽堿脂酶，你選擇什么固定液和固定方法？用什么技術(shù)方法？2、要顯示心肌纖維的超微結(jié)構(gòu)，你選擇什么方法？為什么？40（3） 脫水(dehydration)1）清洗:固定后均用和固定液相同的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘2） 脫水：常用的脫水劑為乙醇和丙酮。How to choose? Why? 乙醇引起組織中脂類物質(zhì)抽提較丙酮少，且不會(huì)使組織變硬、變脆，故為常用脫水劑，然乙醇不容易和用于包埋劑的環(huán)氧樹脂相混溶，因此在進(jìn)入包埋劑之前常用中間劑環(huán)氧丙烷置換。41脫水程序如下表濃度50%70%90%100%時(shí)間10-1510-1

14、510-153次（每次10-15）溫度4oC4oC轉(zhuǎn)室溫室溫42經(jīng)驗(yàn)(experiment)：脫水劑臨時(shí)配制。濃度梯度上升。脫水時(shí)間和濃度。脫水時(shí)的連續(xù)性。脫水劑的選擇。43（4）浸透是通過脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑取代脫水劑，使其滲透到組織中去。 脫水和包埋劑的比例2:11:2純包埋劑時(shí)間1-2h2-3h2h溫度室溫室溫37oC溫箱44經(jīng)驗(yàn)(experiment)：浸透時(shí)間。浸透溫度。45（5） 包埋(embeding)：1)目的:包埋的目的是讓包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅(jiān)硬的固體，成為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支架，能夠承受切片的各種力的作用，有利于切薄片。2)包埋劑的性質(zhì):粘度適中，

15、有良好的切割性能。能耐受電子束的轟擊，高溫不易升華、不變形。透明度好。對(duì)人無(wú)害。463)包埋劑的種類環(huán)氧樹脂類： 目前國(guó)內(nèi)使用較多的環(huán)氧樹脂有進(jìn)口的Epon 812和國(guó)產(chǎn)的618。47 原理:環(huán)氧樹脂具有環(huán)氧基和羥基兩個(gè)主要化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，環(huán)氧基是線型聚合物的末端，易與其它含活性氫原子的化合物如胺類反應(yīng)，形成首尾相接的長(zhǎng)鏈狀聚合物。而單體中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接。因此，將環(huán)氧樹脂、胺類和酸酐三者按比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的交鏈狀聚合物。48這種聚合物收縮率小、均勻，組織損傷小，耐電子束的轟擊。包埋后可保存細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)。其缺點(diǎn)是粘度較大，操作不便、切

16、片較為困難，而且反差較弱。49低粘度包埋劑(Spurr) 為適應(yīng)臨床診斷電鏡的需要，目前低粘度包埋劑的應(yīng)用已日趨廣泛。這是一種低粘度的樹脂，能較好地滲入組織內(nèi)部，對(duì)組織結(jié)構(gòu)保存好，耐電子束轟擊，可廣泛應(yīng)用于各種生物材料，尤其適宜于較致密的組織。 50水溶性包埋劑： 是進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究較理想的包埋劑。 原理:水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進(jìn)行聚合，避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來(lái)的破壞，所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑。 包埋劑:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(簡(jiǎn)稱GMA)、聚乙二醇、Aquon等 51所加的固化劑，有十二烯基虎鉑酸酐（DDSA）和甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐（MNA）,增韌劑為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速劑為2,4,6,一三苯酚（DMP30）。52環(huán)氧樹脂的性能和配制：618樹脂 5ml十二烯基丁二酸酐 DSA（固化劑） 5ml苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑劑） 0.3ml2,4.6三苯酚