1、第二章 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶本章主要內(nèi)容：酶的生產(chǎn)方法；酶生物合成的基本理論；發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制；難點：酶生物合成的誘導(dǎo)和阻遏；發(fā)酵過程細(xì)胞生長與酶合成之間的關(guān)系。重點：酶生物合成的基本理論； 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 目前工業(yè)用酶大多數(shù)來自微生物。經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物細(xì)胞的生命活動獲得所需酶的技術(shù)過程稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。 酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一：選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物！對產(chǎn)酶微生物的要求： （1）

2、產(chǎn)酶量高； （2）易培養(yǎng)和管理； （3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定； （4）利于酶產(chǎn)品的分離純化； （5）安全可靠、無毒性等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 酶發(fā)酵生產(chǎn)的類型1、固體培養(yǎng)發(fā)酵：主要適于各種霉菌的發(fā)酵產(chǎn)酶 培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，經(jīng)滅菌后，接入產(chǎn)酶菌株，在一定條件下發(fā)酵。exp: 麩皮、米糠 酒曲、醬油曲 淀粉酶、蛋白酶優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便，酶濃度高。缺點：勞動強度大，原料利用率低，生產(chǎn)周期長。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、液體深層發(fā)酵（目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式 ） 液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，接入產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下發(fā)酵。適于微生物、動植物細(xì)胞。優(yōu)點：機械化強度高，酶產(chǎn)率高，產(chǎn)品回收率高缺

3、點：技術(shù)管理要求高微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)3、固定化細(xì)胞發(fā)酵（70年代后期發(fā)展） 將細(xì)胞固定在載體上后，進行發(fā)酵生產(chǎn)。優(yōu)點：細(xì)胞密度高，可反復(fù)使用，利于產(chǎn)品分離純化缺點：需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器，只適用胞外酶生產(chǎn)4、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵（80年代中期發(fā)展） 原生質(zhì)體是指除去了細(xì)胞壁的微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。優(yōu)點：解除細(xì)胞壁擴散阻礙；易于細(xì)胞間質(zhì)中的酶的 分泌；可反復(fù)或連續(xù)使用缺點：制備復(fù)雜，維持較高的滲透壓，需防止細(xì)胞壁再生微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)第一節(jié) 微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)一、酶生物合成的基本過程DNARNA蛋白質(zhì)（新生多肽鏈）成熟蛋白質(zhì)（酶）胞內(nèi)胞外轉(zhuǎn)錄翻譯加工分泌或定位微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(

4、12)二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機制，主要是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 按酶生物合成的速度，把細(xì)胞中合成的酶分為兩類：組成酶恒定（速度、濃度）誘導(dǎo)酶在外界環(huán)境因素誘導(dǎo)下合成速度急增，酶濃度成百上千倍增加(適應(yīng)型酶、調(diào)節(jié)型酶)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)1960，Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說闡明；與生物合成相關(guān)的四個基因： 調(diào)節(jié)基因Regulator gene ； 啟動基因Promoter gene ； 操縱基因Operator gene； 結(jié)構(gòu)基因Structural ge

5、ne ；微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 調(diào)節(jié)基因(R)： 可產(chǎn)生一種變構(gòu)蛋白，通過與效應(yīng)物(effector) （包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。 調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)啟動基因（P）（啟動子）： 有兩個位點： （1）RNA聚合酶的結(jié)合位點（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點。CAP：分解代謝物活化劑蛋白，又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)操縱基因（Operater gene）: 位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶

6、合成的時機與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structural gene）: 決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)酶合成的基因調(diào)控類型：誘導(dǎo)和阻遏1、酶合成的誘導(dǎo)作用 加進某些物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速進行的現(xiàn)象，稱為誘導(dǎo)作用。誘導(dǎo)物一般是酶催化作用的底物或其底物類似物。 例：乳糖誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成 淀粉誘導(dǎo)a-淀粉酶的合成微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、酶合成的阻遏（1）終產(chǎn)物阻遏 指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。（2）分解代謝物阻遏 是指某些物質(zhì)經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏其他酶合成的

7、現(xiàn)象。 葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成A1 B1A2 B2EA BE色氨酸過量時會阻遏催化色氨酸合成的相關(guān)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)三、酶生物合成的模式微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長， 其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段 調(diào)整期對數(shù)生長期平衡期衰亡期時間細(xì)胞數(shù)量的對數(shù)（一）微生物生長曲線（Microbial growth curve）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（二）酶生物合成的模式 （1）同步合成型 （2）延續(xù)合成型 （3）中期合成型 （4）滯后合成型 通過分析比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系, 可以把酶的生物合成的模式分為4種

8、類型：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)1、同步合成型酶的生物合成與細(xì)胞的生長同步進行，又稱生長偶聯(lián)型。大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶的生物合成屬于同步合成型。特點：（1）發(fā)酵開始，細(xì)胞生長，酶也開始合成，說明不受分解代謝物和終產(chǎn)物阻遏。（2）生長至平衡期后，酶濃度不再增長，說明mRNA很不穩(wěn)定。時間(h)濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、中期合成型酶的合成在細(xì)胞生長一段時間以后才開始，而在細(xì)胞生長進入平衡期后，酶的合成也停止。特點：（1）該類酶的合成受分解代謝物阻遏。（2）該酶對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。濃度酶濃度細(xì)胞濃度時間(h)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)3、延續(xù)合成型酶的合成伴隨著細(xì)胞生長而開始，但在細(xì)胞

9、進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長的一段時間。特點：（1）該類酶不受分解代謝產(chǎn)物阻遏和終產(chǎn)物阻遏。（2）該酶對應(yīng)的mRNA是相當(dāng)穩(wěn)定的。時間(h)濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)4、滯后合成型只有當(dāng)細(xì)胞生長一段時間或者進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。 特點：（1）該類酶受分解代謝物阻遏作用的影響，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）該酶對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。時間(h)濃度酶濃度細(xì)胞濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞

10、的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。 若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長進入平衡期后的相當(dāng)長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進行酶的生物合成。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)同步合成型中間合成型延續(xù)合成型滯后合成型酶合成起始時間酶合成停止時間產(chǎn)酶與生長相關(guān)特點生長與酶合成偶聯(lián)度酶mRNA穩(wěn)定性酶生物合成與生長關(guān)聯(lián)式比較生長開始對數(shù)期生長開始平衡期衰亡期平衡期后平衡期平衡期同起同停晚起晚停同起晚停晚起同停非偶聯(lián)過渡偶聯(lián)緊密偶聯(lián)很穩(wěn)定較穩(wěn)定不穩(wěn)定不穩(wěn)定微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)小結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素：培養(yǎng)基中阻遏物的存

11、在和mRNA的穩(wěn)定性。（1）不受培養(yǎng)基中某種物質(zhì)阻遏時，可隨著細(xì)胞生長而開始合成；受阻遏的酶，要在細(xì)胞生長一段時間或進入平衡期后，解除阻遏，酶才開始合成。（2） mRNA穩(wěn)定性高的，可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)合成其對應(yīng)的酶；穩(wěn)定性差的，隨著細(xì)胞生長停止而終止酶的合成。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 選擇：在酶的工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高酶產(chǎn)率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式是延續(xù)合成型。 改造非理想模式：在細(xì)胞選育上下功夫，并適當(dāng)調(diào)節(jié)工藝條件：（1）同步合成型： 適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提高酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性。（2）中期合成型： 要從解除阻遏和提高mRNA的穩(wěn)定性兩方面進行努力。（3）滯后合成型 在發(fā)酵過

12、程中要盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。選擇與改造微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)第二節(jié) 產(chǎn)酶微生物的特點用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的微生物必需具備的條件： （1）酶的產(chǎn)量高 （2）容易培養(yǎng)和管理 （3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 （4）利于酶的分離純化 （5）安全可靠微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)新開發(fā)的酶必須按規(guī)定進行下表的各項檢查項目試驗動物急性中毒鼠,大白鼠口服 4周大白鼠12月狗致癌試驗:24月兩重嚙齒動物畸胚組織發(fā)生試驗(24月)兩重嚙齒動物生產(chǎn)病原性試驗四種動物皮膚刺激性試驗(膚,眼)兔子,人抗原性人微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（一）常用的產(chǎn)酶微生物微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)1、細(xì)菌大腸桿菌（Escherichia

13、 coli）形態(tài)：桿狀，革蘭氏陰性，運動或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴展，光滑，閃光。 大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌，一般分泌胞內(nèi)酶。常在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)醋酸桿菌（Acetobacter） 菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，不生芽孢。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。應(yīng)用：有機酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿 )微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili

14、s） 直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 2、放線菌(Actinomycetes)放線菌是一類具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物,由于菌落呈放射狀而得。 放線菌是一類介于細(xì)菌和真菌之間的單細(xì)胞生物。一方面,放線菌的細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞壁的化學(xué)組成與細(xì)菌相似,與細(xì)菌同屬原核生物;另一方面,放線菌菌體呈纖細(xì)的菌絲狀,而且分支,又以外生孢子的形式繁殖,這些特征又與霉菌相似。放線菌菌落中的菌絲常從一個中心向四周輻射狀生長,因此叫放線菌。 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)放線菌產(chǎn)酶舉例 鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶

15、、青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)3、霉菌（molds）霉菌:是一類絲狀真菌。構(gòu)成霉菌菌（個）體的基本單位稱為菌絲（hyphae），呈長管狀，可不斷自前端生長并分支。在固體基質(zhì)上生長時，部分菌絲深入基質(zhì)吸收養(yǎng)料，稱為基質(zhì)菌絲或營養(yǎng)菌絲；向空中伸展的稱氣生菌絲，可進一步發(fā)育為繁殖菌絲，產(chǎn)生孢子。大量菌絲交織成絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀等，稱為菌絲體（mycelium）。菌絲體常呈白色、褐色、灰色，或呈鮮艷的顏色，有的可產(chǎn)生色素使基質(zhì)著色（如赤霉菌等）。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐變質(zhì)，但許多有益種類已被廣泛應(yīng)用，是人類實踐活動中最早利用和認(rèn)識的

16、一類微生物。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)選用不同的霉菌作為發(fā)酵菌種，不僅可以釀制醬、醬油、醋、豆腐乳等食品，還可以應(yīng)用于生產(chǎn)有機酸、酶制劑、維生素、生物堿及激素等多種產(chǎn)品;據(jù)統(tǒng)計，在550種酶制劑中有近1/3是霉菌產(chǎn)生的。霉菌與產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)霉菌產(chǎn)酶舉例 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)生產(chǎn)糖化酶、 -淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、過氧化氫酶、脂肪酶等；黑曲霉（Aspergillus niger）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)米曲霉（Aspergillus oryzae ）生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、氨基?；?、磷酸二酯酶、果膠酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)紅曲霉（Monascus）生產(chǎn)-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋

17、白酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)青霉（Penicillium）青霉是世界分布最廣的幾類真菌之一。生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；?、纖維素酶等。(一)生活習(xí)性 青霉通常在柑桔及其他水果上,冷藏的干酪及被它們的孢子污染的其他食物上均可找到,其分生孢子在土壤內(nèi),空氣中及腐爛的物質(zhì)上到處存在，青霉?fàn)I腐生生活。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)(二)形態(tài) 青霉的營養(yǎng)體為無色或淡色的菌絲體,菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜。整個菌絲體分為伸入營養(yǎng)基質(zhì)中吸取營養(yǎng)的基質(zhì)菌絲和伸向空氣中的氣生菌絲。在氣生菌絲上產(chǎn)生簡單的長而直立的分生孢子梗, 分生孢子為球形至卵形,呈綠色,藍(lán)色或黃色,即通?？吹降母鞣N青霉菌落特有的顏色。微生物發(fā)

18、酵產(chǎn)酶(12)木霉（Trichoderma）木霉具有較強分解纖維素能力。在木質(zhì)素、纖維素豐富的基質(zhì)上生長快，傳播蔓延迅速。棉籽殼、木屑、段木都是其良好的營養(yǎng)物。 生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)根霉(Rhizopus) 根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)4、酵母 啤酒酵母：丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等。 假絲酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（二 ）生產(chǎn)菌種的來

19、源微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)1、向菌種中心購買或索取。 中國國家級菌種保藏管理中心（7個） 名稱 依 托 單 位 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所(ACCC)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院(CICC) 中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心 中國藥品生物制品檢定所(CMCC) 中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 中國獸醫(yī)藥品檢定所(CVCC) 中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國林業(yè)科學(xué)研究院 (CFCC) 中國抗菌素菌種保藏管理中心 中國醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所(CACC) 中國普通微生物菌種保藏管理中心 中國科學(xué)院微生物研究所(CCGMC) 微生物發(fā)酵產(chǎn)

20、酶(12)國外菌種中心American Type Culture Collection Japan Collection of Microorganisms http:/www.jcm.riken.go.jpThe United Kingdom National Culture collection http:/www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen http:/www.dsmz.de ATCC 美國菌種中心，最大的菌種中心,有病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞等不同的微生物 JCM 日本微生物菌種中心 英

21、國國家菌種中心，Over 70,000 micro-organisms and cell lines are available. 德國微生物與細(xì)胞收集中心微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（1）樣品的采集（采樣）：主要是各種富含所需微生物的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等 ；產(chǎn)酶菌種篩選步驟：2、篩選 由自然界采集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選 。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（2）初篩：分離產(chǎn)目的酶的菌株； 給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來。產(chǎn)-淀粉酶菌株的篩選產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（3）復(fù)篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株；

22、在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（三）產(chǎn)酶菌種的保存 保藏方法:斜面保藏法、沙土保藏法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)第三節(jié) 發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件及其控制 發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑，就是給酶的生產(chǎn)菌種提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和生長環(huán)境，使生產(chǎn)菌大量增殖，同時合成所需要的酶，然后由發(fā)酵所得物料制成酶產(chǎn)品。 現(xiàn)代酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)以液體深層發(fā)酵法為主。 無論哪種發(fā)酵法，都要做三方面的工作： （1）從原料準(zhǔn)備培養(yǎng)基； （2）從原始菌種準(zhǔn)備生產(chǎn)菌種； （3）發(fā)酵過程管理。發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 原 料 原始菌種 麩皮

23、等原料 餅粕等原料 淀粉質(zhì)原料 試管斜面培養(yǎng)(活化) 配制培養(yǎng)基 (滅菌)按不同原料 凈化、粉碎 搖瓶等分級擴大培養(yǎng)作不同處理 水解 種子罐培養(yǎng) 淀粉糖液 發(fā)酵罐(液體發(fā)酵) 發(fā)酵池(固體發(fā)酵) 培養(yǎng) 配制培養(yǎng)基 (滅菌) 發(fā)酵液 成品曲 下游加工 液態(tài)酶制劑 固體粗酶制劑 各種精制酶制劑酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程圖微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12) 一、生產(chǎn)種子的制備 生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過活化，擴大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。1、種子制備工藝過程保藏菌種活化培養(yǎng)逐級搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)接種至發(fā)酵罐微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（1 ）菌種活化 目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，

24、必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力。 方法：在試管斜面上培養(yǎng)1-3代。（2 ）擴大培養(yǎng) 目的：活化后的菌種經(jīng)過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。 培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。 方法：分為實驗室培養(yǎng)和車間培養(yǎng)兩個階段。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)擴大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項：（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；（2）培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時間一般控制在微生物生長的對數(shù)生長期，及時接入下一級培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強培養(yǎng)過程的實時監(jiān)測。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)二、培養(yǎng)基1、碳源：提

25、供碳元素；能源。 碳源、氮源、無機鹽、生長因素、水等。 來源：淀粉及其水解物淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯類、玉米、麩皮、米糠等。 此外有些微生物可以采用脂肪、石油、乙醇等為碳源。 注意：在選擇碳源時，應(yīng)盡量選擇對所需酶有誘導(dǎo)作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。 培養(yǎng)基是人工配制的供微生物生長、繁殖及合成酶的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、氮源：提供氮元素。 來源：有機氮：常利用農(nóng)副產(chǎn)品的籽實榨油后的副產(chǎn)品，如豆餅、花生餅、菜子餅等； 無機氮：含氮的無機化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。3、無機鹽：大量元

26、素和微量元素。 基本功能：構(gòu)成細(xì)胞的成分； 構(gòu)成酶產(chǎn)品的組分； 作為酶的激活劑。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)4、生長因子 指微生物生長繁殖所必不可缺的微量有機物，主要包括各種氨基酸、嘌呤或嘧啶、維生素等三類物質(zhì)。 酶制劑中所用的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、麩皮、米糠、酵母膏等。5、水微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)配制培養(yǎng)基的注意事項：（1）培養(yǎng)基的碳氮比是培養(yǎng)基成分配比的重點；（2）碳源和氮源的選擇，要注意避免碳分解代謝阻遏和氮分解代謝阻遏；（3）培養(yǎng)基中無機鹽的選擇要注意鹽類引起的生理酸堿性反應(yīng)；（4）發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基成分配比不可輕易改變。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵

27、產(chǎn)酶培養(yǎng)基舉例1、枯草桿菌BF7658 -淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基： 玉米粉 8% 豆餅粉 4% 磷酸氫二鈉 0.8% 硫酸銨 0.4% 氯化鈣 0.2% 氯化銨 0.15% 自然pH微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基 玉米粉 10% 豆餅 4% 麩皮 1% pH 4.45.0微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（二）培養(yǎng)基的種類1、斜面培養(yǎng)基： 是供菌種生長繁殖使用的 。2、種子培養(yǎng)基： 是供菌種生長繁殖使用的 。3、發(fā)酵培養(yǎng)： 是供菌種生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物合成之用。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)三、發(fā)酵條件的控制1、溫度的調(diào)節(jié)控制（2）有些微生物生長最適溫度與發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度有所不同。例： 醬油曲霉生產(chǎn)蛋

28、白酶，28時蛋白酶產(chǎn)量比在40 條件下高24倍，在20條件下發(fā)酵，則蛋白酶產(chǎn)量更高，但細(xì)胞生長速率較慢。 為此，在有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，要在不同的發(fā)酵階段控制不同的溫度，即在微生物生長階段控制在生長的最適溫度范圍，而在產(chǎn)酶階段控制在產(chǎn)酶最適溫度范圍。（1）不同的微生物有不同的最適生長溫度。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（3）溫度的控制方法 一般采用熱水升溫，冷水降溫。因此，在發(fā)酵罐中均設(shè)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管，夾套、噴淋管等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)2、pH值的調(diào)節(jié)控制（1）不同微生物，其生長繁殖的最適pH值有所不同。（2） 微生物生長的最適pH值與產(chǎn)酶最適pH值往往不同。（3）有些微生物可以同時產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。黑曲霉 -淀粉酶 糖化酶pH值中性 pH值偏酸性 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(12)（4）影響pH值的因素一般來說，培養(yǎng)基成分中C/N比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N比低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。不同鹽的利用對pH也會產(chǎn)生影響。（5）生產(chǎn)中控制pH值的方法添加緩沖液維持一定的pH值（如磷酸鹽）；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH，保持一定的C/N比；發(fā)酵液中