1、水環(huán)境中輪狀病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)1輪狀病毒是重要的水介傳播病原體, 其感染性強(qiáng), 穩(wěn)定性高是水環(huán)境中危害嚴(yán)重的病原微生物, 快速、準(zhǔn)確地檢測水環(huán)境中的輪狀病毒對于控制疾病爆發(fā)和保障水質(zhì)公共衛(wèi)生安全極為重要2 通過水傳播的病原微生物是危害人類健康和生態(tài)安全的重大隱患, 全世界約有1/ 4 的疾病是由水中病原微生物直接或間接引起的 。輪狀病毒是水環(huán)境中廣泛存在的病原微生物之一, 主要來自人和動物的排泄物 。在全球范圍內(nèi), 輪狀病毒是引起腹瀉最主要的原因, 每年因水傳播輪狀病毒造成腹瀉人數(shù)約為 111 億, 死亡人數(shù)高達(dá) 44 萬 。3輪狀病毒分子生物學(xué)特征輪狀病毒( Rotavir s, RV)

2、 隸屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬。成熟完整的RV 粒子在電鏡下呈球型, 車輪狀, 為20 面立體對稱形, 直徑60 80 nm, 無包膜, 具有3 層蛋白質(zhì)衣殼結(jié)構(gòu)( 包括核心、內(nèi)衣殼和外衣殼) 。內(nèi)衣殼的殼粒沿病毒邊緣呈放射狀排列, 形同車輪輻條; 外衣殼薄而光滑,包繞內(nèi)衣殼,。同時(shí)具備內(nèi)外雙層衣殼才具有感染性, 這是因?yàn)殡p層衣殼中含有聚合酶和其他一些能產(chǎn)生mRNA 的酶 。41 、濾膜吸附法 常用的濾膜有表面帶正電荷和負(fù)電荷的兩種。在使用尼龍膜、硝酸纖維膜等負(fù)電荷濾膜時(shí)需多價(jià)陽離子( 如 Al、Mg ) 和低pH 值條件( 通常為35) , 使濾膜表面帶正電荷, 從而吸附帶負(fù)電荷的病毒; 而

3、在使用正電荷濾膜時(shí)則可直接從水中吸附病毒, 再用洗脫液洗脫病毒。一、水中輪狀病毒檢測的前處理技術(shù)52 、固體顆粒吸附法 將荷電樹脂、玻璃粉、羥磷灰石、磁性氧化鐵和硅藻土等固體顆粒裝柱, 水樣流動過柱, 再用小體積洗脫液洗脫被吸附的病毒, 洗脫后得到濃縮樣品。63 、免疫捕獲法免疫捕獲法是利用抗體和抗原特異性結(jié)合的原理, 將高特異性的純化抗體交聯(lián)于層析材料上, 裝填成柱, 或?qū)⒖贵w包被于磁珠表面, 形成免疫磁珠。被測水樣流過柱或與免疫磁珠攪拌后, 用洗脫液洗脫, 即可得到純度很高的被檢測病毒。7二、輪狀病毒的分子生物學(xué)檢測技術(shù) 1、 輪狀病毒RNA 的提取主要有3 種: 1) Trizol 法,

4、 其主要成分是酚和異硫氫酸胍的混合液, 用于組織和細(xì)胞總RNA 的提取時(shí)能保持RNA 的完整性2) 柱層析純化法, 采用Sephadex、CC41 纖維素等層析材料, 在特定的離子濃度下, 可以吸附或洗脫核酸, 快速去除雜質(zhì), 純化濃縮核酸樣品3) 抗原捕獲法, 采取交聯(lián)或包被于固相上的特異抗體與病毒抗原結(jié)合, 經(jīng)洗滌, 更換緩沖液, 直接加熱裂解病毒, 獲得純度很高的核酸。82、基于基因芯片技術(shù)檢測水中輪狀病毒基因芯片又叫做 DNA 芯片、DNA 微陣列, 是指采用原位合成或合成后點(diǎn)樣等方法, 將大量基因探針以大規(guī)模陣列的形式有序地固定于面積很小的固體介質(zhì)表面通過與標(biāo)記后被檢測基因的堿基序列雜交, 再通過掃描系統(tǒng)檢測探針分子雜交信號, 實(shí)現(xiàn)核酸序列分子識別。9免疫技術(shù)與PCR 相結(jié)合檢測水中輪狀病毒，該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和PCR 反應(yīng)的高敏感性結(jié)合起來, 旨在通過聯(lián)級放大提高檢測靈敏度, 降低檢測體系內(nèi)抑制劑的干擾, 是迄今最敏感的病原微生物檢測方法。目前國內(nèi)外報(bào)道該方法的敏感性一般比現(xiàn)行的ELISA 法高 100 10000倍