1、實驗八 凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白的含量1一、實驗目的1.掌握凱氏定氮法測定蛋白質含量的原理和方法。2.學會使用凱氏定氮儀。 2二、實 驗 原 理1.消化：有機物中的胺根在強熱和CuSO4/K2SO4，濃H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4； 2NH3+H2S04+2H+ (NH4)2S042.蒸餾：在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中； (NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O33.滴定:用已知濃度的HCI標準溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應的

2、換算因子，既得蛋白質的含量。 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3 二、實 驗 原 理41、豆?jié){粉2、濃硫酸3、混合催化劑：CuSO4/K2SO4=0.4/64、混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液200ml與0.1%甲 烯藍乙醇溶液50ml混合5、 NaOH:40%6、 2%硼酸溶液7、0.01N標準鹽酸溶液三、實驗器材5四、實驗步驟（一）消化 精密稱取豆?jié){粉1.0 g，移入干燥消化管中，加入混合催化劑6.4g，搖勻后再加入15ml濃硫酸和兩顆玻璃珠，放入消化爐中消化。起始電壓150V，消化1h后，觀察消化管內(nèi)泡沫變化，泡沫消失后，加強火力到220V，繼續(xù)消化，至

3、液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。 取下消化管放冷，小心加蒸餾水至50ml ，混勻備用。取與處理樣品相同量的混合催化劑按同一方法做試劑空白試驗。6（二）蒸餾（1）裝好蒸餾裝置，如圖：四、實驗步驟7（2）洗滌蒸餾裝置在蒸氣發(fā)生燒瓶中加約70顆玻璃珠，2/3體積的蒸餾水，加入45滴濃硫酸及45滴混合指示劑。沿小漏斗加入蒸餾水約20mL到反應室，留半漏斗水，保持水封，防止漏氣。加熱產(chǎn)生蒸氣后，立即關閉廢液排放管上的開關，蒸氣進入反應室，導致反應室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。四、實驗步驟8從定氮球發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮

4、5min，停止加熱。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接硅膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應室內(nèi)廢液自動抽到蒸汽收集器中，打開廢液排出口夾子放出廢液。四、實驗步驟9（3）蒸餾樣品向接收瓶內(nèi)加入20ml2%硼酸溶液及混合指示液2滴，并使冷凝管的下端插入液面下吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小漏斗流入反應室，并以5ml水洗滌小燒杯使流入反應室內(nèi)。將10ml40%氫氧化鈉溶液經(jīng)小漏斗緩緩流入反應室，立即加半漏斗水水封以防漏氣，開始蒸餾。蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內(nèi)，從指示劑開始變色時計時，蒸餾5min。移動接受瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min。四、實驗步驟10（三）滴定 用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N鹽酸標準溶液滴定至淡紫紅色為滴定終點。(四)洗滌凱氏定氮儀（按照上述方法）四、實驗步驟11五、實驗結果樣品的總氮含量(%)=(AB)0.1145/1000C若測定的樣品含氮部分只是蛋白質(如血清)，則：樣品中的蛋白質含量(%)=(AB)0.1146.255/1000CA滴定樣品用去