1、專題二 微生物得培養(yǎng)與應(yīng)用課題一 微生物得實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 培養(yǎng)基 : 人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖得營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，就是進(jìn)行微生物培養(yǎng)得物質(zhì)基礎(chǔ)。 培養(yǎng)基按照 物理性質(zhì) 可分為 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 與 固體培養(yǎng)基 。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑 瓊脂 ( 就是從紅藻中提取得一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后, 制成瓊脂固體培養(yǎng)基 . 微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見(jiàn)得菌落 . 根據(jù)菌落得特征可以判斷就是哪一種菌。液體培養(yǎng)基 應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn) , 固體培養(yǎng)基 應(yīng)用于微生物得分離與鑒定, 半固體培養(yǎng)基 則常用于觀察微生物得運(yùn)動(dòng)及菌種保藏等 . 按照 成分 培養(yǎng)

2、基可分為 人工合成培養(yǎng)基 與天然培養(yǎng)基 。合成培養(yǎng)基 就是用成分已知得化學(xué)物質(zhì)配制而成 , 其中成分得種類比例明確 , 常用于微生物得分離鑒定。天然培養(yǎng)基 就是用化學(xué)成分不明得天然物質(zhì)配制而成 , 常用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。 按照培養(yǎng)基得 用途 ，可將培養(yǎng)基分為 選擇培養(yǎng)基 與鑒定培養(yǎng)基 。選擇培養(yǎng)基 就是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要得微生物生長(zhǎng) , 促進(jìn)所需要得微生物得生長(zhǎng)。鑒別培養(yǎng)基 就是根據(jù)微生物得特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成得 , 用以鑒別不同類別得微生物。 培養(yǎng)基得化學(xué)成分包括水、 無(wú)機(jī)鹽、 碳源、 氮源 、生長(zhǎng)因子 等。 碳源：能為微生物得代謝提供碳元素

3、得物質(zhì)。如CO2、 C 3等無(wú)機(jī)碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。 氮源：能為微生物得代謝提供氮元素得物質(zhì)。如 N2、NH3、N、NH4 +( 無(wú)機(jī)氮源） 蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨 ( 有機(jī)氮源）等。只有固氮微生物才能利用 N。 培養(yǎng)基還要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì) p、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣得要求。例如，培養(yǎng) 乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加 維生素 ，培養(yǎng) 霉菌 時(shí)須將培養(yǎng)基得 p調(diào)至 酸性 , 培養(yǎng) 細(xì)菌 就是需要將 pH調(diào)至 中性或微堿性，培養(yǎng) 厭氧型微生物 就是則需要提供 無(wú)氧 得條件 無(wú)菌技術(shù) 獲得純凈培養(yǎng)物得關(guān)鍵就是防止外來(lái)雜菌得入

4、侵，要注意以下幾個(gè)方面 : 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作得空間、操作者得衣著與手，進(jìn)行清潔與消毒。將用于微生物培養(yǎng)得器皿、接種用具與培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物得污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理得材料用具與周圍得物品相接觸。無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室得培養(yǎng)物被其她外來(lái)微生物污染外 , 還有什么目得？答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。 消毒與滅菌得區(qū)別消毒 指使用較為溫與得物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害得微生物 ( 不包括芽孢與孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法 ，巴氏消毒法 （對(duì)于一些不耐高溫得液體）還有 化學(xué)藥劑 （如酒精、氯氣、

5、石炭酸等 ) 消毒、 紫外線消毒 。滅菌 則就是指使用強(qiáng)烈得理化因素殺死物體內(nèi)外所有得微生物，包括芽孢與孢子。 滅菌方法有 灼燒滅菌 、 干熱滅菌 、高壓蒸汽滅菌 。滅菌方法 : 接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；?玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械就是干熱滅菌箱 ; 培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械就是高壓蒸汽滅菌鍋 . 表面滅菌與空氣滅菌等使用紫外線滅菌法 , 所用器械就是紫外燈。比較項(xiàng) 理化因素得作用強(qiáng)度 消滅微生物得數(shù)量 芽孢與孢子能否被消滅消毒 較為溫與 部分生活狀態(tài)得微生物 不能滅菌 強(qiáng)烈 全部微生物 能制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(1) 方法步驟：計(jì)算、

6、稱量、溶化、滅菌、倒平板。（2) 倒平板操作得步驟：將滅過(guò)菌得培養(yǎng)皿放在火焰旁得桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基得錐形瓶，左手拔出棉塞 . 右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過(guò)火焰。用左手得拇指與食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口得縫隙，右手將錐形瓶中得培養(yǎng)基 ( 約 20L) 倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿得皿蓋。等待平板冷卻凝固，大約需 在上 . 倒平板操作得討論 1、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到 得溫度？51min。然后 , 將平板倒過(guò)來(lái)放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底50左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。您用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基提示： 可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基得錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶得溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了 .

7、 2、為什么需要使錐形瓶得瓶口通過(guò)火焰 ? 答: 通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口得微生物污染培養(yǎng)基。3、平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答: 平板冷凝后， 皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠 , 凝固后得培養(yǎng)基表面得濕度也比較高，將平板倒置， 既可以使培養(yǎng)基表面得水分更好地?fù)]發(fā) , 又可以防止皿蓋上得水珠落入培養(yǎng)基 , 造成污染 . 、在倒平板得過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間得部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么 ? 答：空氣中得微生物可能在皿蓋與皿底之間得培養(yǎng)基上滋生，微生物。純化大腸桿菌因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)（1）微生物接種得方法最常用得就是 平板劃線法 與稀釋涂布平板法。( ）平板劃線法就

8、是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線得操作。將聚集得菌種 逐步稀釋 分散到培養(yǎng)基得表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng) 見(jiàn)得子細(xì)胞群體 , 這就就是菌落。, 可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)得肉眼可(3) 稀釋涂布平板法就是將菌液進(jìn)行一系列得梯度稀釋 , 然后將不同稀釋度得菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基得表面，進(jìn)行培養(yǎng). 分為系列 稀釋操作 與 涂布平板操作 兩步。(4 ）用平板劃線法與稀釋涂布平板法接種得 目得 就是：使聚集在一起得微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)得菌落，以便于純化菌種 . (5 ）平板劃線法操作步驟：將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞 .

9、 將試管口通過(guò)火焰 . 將已冷卻得接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液 . 將試管通過(guò)火焰 , 并塞上棉塞。 左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙 , 右手將沾有菌種得接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)， 劃三至五條平行線 , 蓋上皿蓋。 注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)皿 . 灼燒接種環(huán)， 待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線得末端開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作, 在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線. 注意不要將最后一區(qū)得劃線與第一區(qū)相連。將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 平板劃線操作得討論、為什么在操作得第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時(shí), 仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作得第一步灼燒接種環(huán)就是為了避免接種環(huán)上可能存在得微生物污染培養(yǎng)物

10、；每次劃線前灼燒接種環(huán)就是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留得菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上得菌種直接來(lái)源于上次劃線得末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)得增加，使每次劃線時(shí)菌種得數(shù)目逐漸減少 , 以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留得菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境與感染操作者。2、在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高 , 殺死菌種。3、在作第二次以及其后得劃線操作時(shí), 為什么總就是從上一次劃線得末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌得數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線得末端開(kāi)始，能使細(xì)菌得數(shù)目隨著劃線次數(shù)得增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)得

11、菌落。(6) 涂布平板操作得步驟: , 待酒精燃盡后，冷卻810s. 將涂布器浸在盛有酒精得燒杯中. 取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面. 將沾有少量酒精得涂布器在火焰上引燃用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面. 涂布平板操作得討論涂布平板得所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋得無(wú)菌操作要求，想一想，第步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？提示 : 應(yīng)從操作得各個(gè)細(xì)節(jié)保證“ 無(wú)菌” 。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿得距離要合適、吸管頭不要接觸任何其她物體、吸管要在酒精燈火焰周圍 ; 等等。菌種得保存（1) 對(duì)于頻繁使用得菌種，可以采用 臨時(shí)保藏 得方法。臨時(shí)保藏方法將菌種接種到試管得固體斜面培養(yǎng)基上，在合適得溫

12、度下培養(yǎng). 當(dāng)菌落長(zhǎng)成后 , 將試管放入 得冰箱中保藏 . 以后每 36 個(gè)月，都要重新將菌種從舊得培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮得培養(yǎng)基上。缺點(diǎn) ：這種方法保存得時(shí)間不長(zhǎng)，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異 . （2）對(duì)于需要長(zhǎng)期保存得菌種，可以采用 甘油管藏 得方法。在 3mL得甘油瓶中 , 裝入 1甘油后滅菌。將1L 培養(yǎng)得菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后 , 放在 20 得冷凍箱中保存。疑難解答（1）生物得營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)就是指生物攝取、利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得過(guò)程. 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就是指維持機(jī)體生命活動(dòng), 保證發(fā)育、生殖所需得外源物質(zhì)。人及動(dòng)物得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。植物得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、

13、水、二氧化碳等三類。微生物得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類 . （2) 確定培養(yǎng)基制作就是否合格得方法將未接種得培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫天 得, 否則需要重新制備。, 無(wú)菌落生長(zhǎng) , 說(shuō)明培養(yǎng)基得制備就是成功課題二 土壤中分解尿素得細(xì)菌得分離與計(jì)數(shù)尿素就是一種重要得農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收. 只有當(dāng)土壤中得細(xì)菌將尿素分解成氨之后, 才能被植物利用. 土壤中得細(xì)菌之所以能分解尿素，就是因?yàn)樗齻兡芎铣呻迕浮Ｄ蛩刈畛蹙褪菑娜说媚蛞褐邪l(fā)現(xiàn)得?篩選菌株( ）實(shí)驗(yàn)室中微生物得篩選應(yīng)用得原理人為提供有利于目得菌株生長(zhǎng)得條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、 生物生長(zhǎng)。（2）選擇性培養(yǎng)基H等），同

14、時(shí)抑制或阻止其她微在微生物學(xué)中 , 將允許特定種類得微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其她種類微生物生長(zhǎng)得 培養(yǎng)基 , 稱作 選擇培養(yǎng)基 。(3 ）配制選擇培養(yǎng)基得依據(jù) 根據(jù)選擇培養(yǎng)得菌種得生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇得目得 . 例如，培養(yǎng)基中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素 生物；加入高濃度得食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目, 可以選擇培養(yǎng)能固氮得微( ) 測(cè)定微生物數(shù)量得常用方法有稀釋涂布平板法與顯微鏡直接計(jì)數(shù)。(2 ）稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌得數(shù)目得原理當(dāng)樣品得稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)得一個(gè)菌落, 來(lái)源于樣品稀釋液中得一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上得

15、菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活細(xì)菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置 3 個(gè)平板， 選擇菌落數(shù)在 30 00 得平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值 . 統(tǒng)計(jì)得菌落數(shù)往往比活菌得實(shí)際數(shù)目低 , 因此 , 統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不就是活菌數(shù)來(lái)表示。采用此方法得注意事項(xiàng) :1 、一般選取菌落數(shù)在 0300 之間得平板進(jìn)行計(jì)數(shù) 2、為了防止菌落蔓延 , 影響計(jì)數(shù) , 可在培養(yǎng)基中加入 設(shè)置對(duì)照TC 3、本法僅限于形成菌落得微生物設(shè)置對(duì)照得主要目得就是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果得 可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)就是指除了被測(cè)試得條件以外 , 其她條件都相同得實(shí)驗(yàn) , 其作用就是比照試 驗(yàn)組，排除任何

16、其她可能原因得干擾，證明確實(shí)就是所測(cè)試得條件引起相應(yīng)得結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) , 所需儀器、 材料、用具與藥品 , 具體得實(shí)施步驟以及時(shí)間安排等 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括實(shí)驗(yàn)方案 得綜合考慮與安排。（1）土壤取樣：同其她生物環(huán)境相比，土壤中得微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機(jī)質(zhì)得土壤表層，有更多得微生物生長(zhǎng)。從富含有機(jī)物、潮濕、 去表層土，在距地表約 38c得土壤層取樣。H得土壤中取樣。鏟(2) 樣品得稀釋 : 樣品得稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng)得菌落數(shù)目 . 在實(shí)際操作中，通常選用一定稀釋范圍得樣品液進(jìn)行培養(yǎng) , 以保證獲得菌落數(shù)在 30 到 30之間、 適于計(jì)數(shù)得平板。測(cè)定土壤中細(xì)菌得數(shù)量，一般選用 0

17、10 5 10 4 測(cè)定放線菌得數(shù)量，一般選用 10 1 102 測(cè)定真菌得數(shù)量 , 一般選用 10 10 1( ）微生物得培養(yǎng)與觀察不同種類得微生物, 往往需要不同得培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌307 1 2 天放線菌 2528 57 天 霉菌 8 4 天每隔 24 小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)得記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致一樓菌落得數(shù)目。一般來(lái)說(shuō), 在一定得培養(yǎng)條件下（相同得培養(yǎng)基、唯獨(dú)及培養(yǎng)時(shí)間）, 同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定得菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色。疑難解答 (1 ）如何從平板上得菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中得菌落數(shù)？統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上得菌落數(shù)，最好能統(tǒng)

18、計(jì)3 個(gè)平板， 計(jì)算出平板菌落數(shù)得平均值每克樣品中得菌落數(shù)(C/V) M 其中，代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)得平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用得稀釋液得體積（m),M 代表稀釋倍數(shù)課題三 分解纖維素得微生物得分離纖維素 , 一種由葡萄糖首尾相連而成得高分子化合物，就是地球上含量最豐富得多糖類物質(zhì). 纖維素與纖維素酶(1) 棉花就是自然界中纖維素含量最高得天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。（2) 纖維素酶就是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C酶、 C酶與葡萄糖苷酶, 前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖. 纖維素最終被水解成葡萄糖 , 為微生物得生長(zhǎng)提供營(yíng)

19、養(yǎng)。纖維素分解菌得篩選(1) 篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過(guò)顏色反應(yīng)直接對(duì)微生物進(jìn)行篩選。（ ) 剛果紅染色法篩選纖維素分解菌得原理剛果紅就是一種染料，它可以與像纖維素這樣得多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不與水解后得纖維二糖與葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素得培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中得纖維素形成紅色復(fù)合物 . 當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后 , 剛果紅纖維素得復(fù)合物就無(wú)法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心得透明圈。這樣 , 我們就可以通過(guò)就是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌 . 分離分解纖維素得微生物得實(shí)驗(yàn)流程土壤取樣選擇培養(yǎng) ( 此步就是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目得菌株數(shù)量得多少來(lái)確定）梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌得培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈得菌落(1 ）土壤采集 選擇富含纖維素得環(huán)境。(2 ）剛果紅染色法分離纖維素分解菌得步驟 (3 ）剛果紅染色法種類倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板一種就是先培養(yǎng)微生物, 再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng), 另一種就是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。課題延伸對(duì)分解纖維素得微生物進(jìn)行了初步得篩選后, 只就是分離純化得第一步，為確定得到得就是纖維素分解菌, 還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維