1、 利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征來(lái)確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)，稱(chēng)為光譜分析技術(shù)。吸收光譜分析法發(fā)射光譜分析散射光譜分析第二章 光譜分析技術(shù)光是電磁波，可用波長(zhǎng)“”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長(zhǎng)的光譜所組成，對(duì)于生物化學(xué)來(lái)說(shuō)，最重要的波長(zhǎng)區(qū)域是可見(jiàn)光和紫外光。光的波長(zhǎng)是二個(gè)相鄰的波峰之間的距離。光的傳播是由相互垂直的電場(chǎng)分量“E”和磁場(chǎng)分量“H”所構(gòu)成。C/波長(zhǎng) C光速 頻率，單位時(shí)間通過(guò)一個(gè)定點(diǎn)的波數(shù)。 紫外可見(jiàn)吸收光譜的形成 按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時(shí)，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光

2、，吸收光的頻率和兩個(gè)能級(jí)間的能量差要符合下列關(guān)系：EE2- E1hE1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長(zhǎng)愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長(zhǎng)愈長(zhǎng)）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因?yàn)榉肿愚D(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)及電子能級(jí)躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)級(jí)差小，E0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動(dòng)能級(jí)縱間的差別較大， E0.051.0 ev，振動(dòng)光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級(jí)的級(jí)差更大， E120 ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見(jiàn)

3、、紫外或波長(zhǎng)更短的光譜區(qū)?？梢?jiàn)光、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價(jià)電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個(gè)低能級(jí)的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級(jí)軌道（稱(chēng)為反鍵軌道）。 若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長(zhǎng)作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫(huà)出連續(xù)的“A”或“T”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。曲線上“A”處稱(chēng)最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱(chēng)最大吸收波長(zhǎng)，以max表示。曲線上“B”處有一谷，稱(chēng)最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱(chēng)最小吸

4、收波長(zhǎng)，以min 表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱(chēng)肩峰。在吸收曲線的波長(zhǎng)最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱(chēng)為末端吸收。max是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，max、min、肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。 常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實(shí)驗(yàn)公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個(gè)化

5、合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。常用的術(shù)語(yǔ) 紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n*、*、 n* 等電子躍遷的基團(tuán)稱(chēng)為發(fā)色團(tuán)。例如：CC、CO等發(fā)色團(tuán)。助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)200 nm處沒(méi)有

6、吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱(chēng)為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生 n* 躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)，稱(chēng)為蘭移（或深色效應(yīng)）。增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對(duì)紫外光的吸收明顯增加，即 值（吸光系數(shù)或稱(chēng)消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測(cè)量。減色效應(yīng)（hypochromic effect）:在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時(shí)值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分子值較低的水平，即此時(shí)DNA或RNA溶

7、液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱(chēng)為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測(cè)量。有色溶液對(duì)可見(jiàn)光線有選擇性的吸收作用，有些無(wú)色溶液，所含物質(zhì)可以吸收特定波長(zhǎng)的紫外線或紅外線。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同波長(zhǎng)光線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。利用紫外光、可見(jiàn)光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱(chēng)為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱(chēng)為分光光度計(jì)。分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣。第二章 光譜分析技術(shù)第一節(jié) 朗伯-比爾（Lambert-beer）光吸收定

8、律第二節(jié) 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu) 第三節(jié) 光度法的誤差第四節(jié) 分光光度法的應(yīng)用第五節(jié) 原子吸收分光光度法第六節(jié) 熒光分析法第七節(jié) 散射光譜分析法第一節(jié) 朗伯-比爾（Lambert-beer）1.1 朗伯-比爾（Lambert-beer）光吸收定律：A：吸光度，又稱(chēng)光密度“OD”T：透光度， TI / I0I0：照射到吸收池上的光強(qiáng)It：透過(guò)吸收池的光強(qiáng)。1.2 吸光度、溶液濃度及液層厚度之間關(guān)系： A =bC：摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)，Lmol-1cm-1b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地。C：樣品濃度，molL-1摩爾吸光系數(shù)是物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的

9、能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測(cè)定的靈敏度就越高。值越大，說(shuō)明電子躍遷的幾率大，通常 10105：一般認(rèn)為 104為強(qiáng)吸收；103104 為較強(qiáng)吸收； 102 為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。1.3 應(yīng)用朗伯-比耳定律的條件：入射光波長(zhǎng)應(yīng)為max，且單色性好；被測(cè)溶液具有均勻性、非散射性(不渾濁，也不呈膠體)；被測(cè)物質(zhì)的濃度應(yīng)在一定范圍內(nèi)；朗伯-比耳定律不僅適用于可見(jiàn)光，也適用于紅外光和紫外光；朗伯-比耳定律不僅適用于均勻非散射的液體，也適用于固體和氣體。因此，它是各類(lèi)吸光光度法定量的依據(jù)，用途很廣。第二節(jié) 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu) 2.1 常見(jiàn)的分光光度計(jì)類(lèi)型2.2 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu) 2.2.1 電光

10、源系統(tǒng) 2.2.2 樣品室 2.2.3 單色器2.1 常見(jiàn)的分光光度計(jì)類(lèi)型 2.1.1 單光束分光光度計(jì)2.1.2 雙光束分光光度計(jì)2.1.3 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)2.1.4 光多道二極管陣列檢瀏分光光度計(jì)2.1.1 單光束分光光度計(jì)早期的分光光度計(jì)都是單光束的，例如751型、75lG型，有些仍為手動(dòng)操作，即固定在某一波長(zhǎng)，分別測(cè)量比較樣品、空白或參比液的透光率或吸光度，操作比較費(fèi)時(shí)，要求光源和檢測(cè)器的供電電壓穩(wěn)定性高，用于繪制吸收光譜圖時(shí)很不方便，但其光路簡(jiǎn)單，能量損失小，適用于物質(zhì)的定量分析。2.1.2 雙光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)是目前發(fā)展最快，應(yīng)用最為普遍的一種。既可直接讀數(shù)，又可掃描

11、圖譜。因?yàn)閱紊饽茉诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)交替通過(guò)空白和樣品溶液，所以可以減小因光源強(qiáng)度不穩(wěn)帶來(lái)的誤差。雙光束分光光度計(jì)在測(cè)量過(guò)程中不需移動(dòng)吸收池，可在隨意改變波長(zhǎng)的同時(shí)記錄吸光度。其操作簡(jiǎn)單，測(cè)量快速，自動(dòng)化程度高。測(cè)定含量時(shí)，為準(zhǔn)確起見(jiàn)，仍宜用固定波長(zhǎng)測(cè)量方式。2.1.3 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)是將光源發(fā)出的光分成兩束，分別進(jìn)人各自的單色器，獲得兩束波長(zhǎng)可任意調(diào)節(jié)的單色光，然后交替照射到同一個(gè)吸收池，到達(dá)同一檢測(cè)器，測(cè)得在兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度差值A(chǔ)，A與被測(cè)組分的量成正比。此法可消除參比和樣品溶液組成不一致及比色池不匹配帶來(lái)的誤差，主要用于存在干擾組分的樣品、渾濁樣品和多組分混合樣品的測(cè)定。

12、但儀器價(jià)格昂貴，體積較大。2.1.4 光多道二極管陣列檢瀏分光光度計(jì)光多道二極管陣列檢測(cè)分光光度計(jì)是一種具有全新光路系統(tǒng)的儀器。具有光譜響應(yīng)寬、數(shù)字化掃描準(zhǔn)確、性能比較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。由于全部波長(zhǎng)同時(shí)被檢測(cè)，而且光二極管的響應(yīng)很快，一般可在0.1s的極短時(shí)間內(nèi)獲得190820nm范圍的全光光譜，可作為追蹤化學(xué)反應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的重要工具。隨著儀器的改進(jìn)和計(jì)算機(jī)的應(yīng)用，又出現(xiàn)了許多新的測(cè)量技術(shù)，如14階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)量技術(shù)、三波長(zhǎng)分光光度法、速率分析或動(dòng)力學(xué)分析等。 2.2 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示系統(tǒng)2.2.1 電光源系統(tǒng)2.2.2 樣品室2.2.3 單色器2.2.1 電光源系統(tǒng)

13、可見(jiàn)光源：鎢/鹵鎢燈(320-2500nm)，鹵鎢燈更好。紫外光源：氫燈和氘燈發(fā)光二極管，氘燈(160-375nm)，氘燈產(chǎn)生的光譜強(qiáng)度比氫燈大35倍，而且壽命也比氫燈長(zhǎng)。 紅外光源：碘鎢燈(近紅外)、能斯持燈(中紅外)、汞燈(遠(yuǎn)紅外)。線光源：空心陰極燈/金屬(汞/鈉)蒸汽燈激光光源：固體/氣體/染料激光器熒光分光光度計(jì)多用球形氙燈原子吸收光譜儀多用原子光譜燈，要求輻射的原子光譜線半寬度要窄，以利于提高儀器的靈敏度。能斯特?zé)羰怯赦?、鋯、釷和釔等氧化物燒結(jié)而成的長(zhǎng)約2cm、直徑約1mm的實(shí)心或空心棒組成，工作溫度可達(dá)13001700，其發(fā)射的波長(zhǎng)范圍約為130m，它的壽命較長(zhǎng)、穩(wěn)定性好。對(duì)短波

14、范圍輻射效率優(yōu)于硅碳棒，但價(jià)格較貴，操作不如硅碳棒方便。硅碳棒是由碳化硅燒結(jié)而成的實(shí)心捧，工作溫度達(dá)12001500。對(duì)于長(zhǎng)波，其輻射效率高于能斯特?zé)?，其使用波長(zhǎng)范圍比能斯特?zé)魧?，發(fā)光面大，操作方便、廉價(jià)。島津熒光分光光度計(jì) RF-5301PC熒光分光光度計(jì)在越來(lái)越多的領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用，比如生命科學(xué)中的定性定量分析，化學(xué)中的光化學(xué)反應(yīng)的研究，食品中的殘留農(nóng)藥檢測(cè)和環(huán)境中大氣、水質(zhì)、土壤的污染評(píng)估。相比于吸光度法，熒光法的靈敏度更高，選擇性也更好，把激發(fā)光、熒光波長(zhǎng)相結(jié)合，可以測(cè)定混合物。RF-5301PC作為新一代的熒光分光光度計(jì)具有高水平的性價(jià)比和功能強(qiáng)大的軟件，從日常分析到科學(xué)研究都發(fā)

15、揮了極大的作用原子吸收光譜儀的光源主要采用空心陰極燈。空心陰極燈的結(jié)構(gòu)如左圖所示。1紫外玻璃窗口；2石英窗口，3密封4玻璃套，5云母屏蔽；6陽(yáng)極；7陰極；8支架；9管座，10連接管腳2.2.2 樣品室紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)的樣品室內(nèi)裝有比色皿，可以是玻璃或石英比色皿?？梢?jiàn)光范圍用玻璃比色皿。紫外光范圍用石英比色皿。原子吸收光譜儀的樣品室為原子化器，常用的原子化器有火焰和石墨爐。2.2.3 單色器凡能把復(fù)合光分解為按波長(zhǎng)順序排列的單色光，并能通過(guò)出射狹縫分離出某一波長(zhǎng)單色光的儀器，稱(chēng)為單色器。分光光度計(jì)中所用的單色器有兩種類(lèi)型：棱鏡單色器和光柵單色器。 單色器主要部分都是由入光狹縫

16、、出光狹縫、色散元件、準(zhǔn)直鏡以及附屬機(jī)械裝置所組成。入光狹縫起著限制復(fù)合光進(jìn)入單色器的作用；色散元件起著把復(fù)合光分解為單色光的作用；準(zhǔn)直鏡的作用一是把來(lái)自入光狹縫的光轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫泄?，投射到色散元件上，作用二是把?lái)自色散元件的平行光束聚焦于出光狹縫上，形成光譜像；出光狹縫是單色光的出口。它只讓光譜帶中額定波長(zhǎng)的光從狹縫中透出，而將其他波長(zhǎng)的光擋住，不許其通過(guò)。 1、棱鏡單色器30利特羅（Litrow）式（自準(zhǔn)式）60棱鏡利特羅（Litrow）式瓦茲渥斯（Wadsworch）式澤尼特（Czerny-Turner）式光從一種介質(zhì)射到另一種介質(zhì)時(shí)，一部分光從界面反射回去稱(chēng)為反射， 另一部分光則改變前進(jìn)方

17、向進(jìn)入第二種介質(zhì)稱(chēng)為折射。若入射角為i、折射角為，則其折射率n為：n=sini/sin。不同的光學(xué)材料具有不同的折射率，即便是同一種光學(xué)材料以相同的入射角照射，若波長(zhǎng)不同，得到的折射角也不一樣。 2、光柵單色器光路圖 光柵色散均勻、譜線清晰、工作波段寬，是棱鏡無(wú)法比擬的。再加上它所組成的單色器的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，所以近年來(lái)逐步取代了棱鏡，而成為色散元件的主角。光柵原是指大量等寬、等間距的平行狹縫所組成的光學(xué)元件，是一種多狹縫部件，光柵光譜的產(chǎn)生是多狹縫干涉和單狹縫衍射兩者聯(lián)合作用的結(jié)果。多縫干涉決定光譜線出現(xiàn)的位置，單狹縫衍射決定譜線的強(qiáng)度分布。 光柵分為平面透射光柵和反射光柵，反射光柵應(yīng)用更廣泛

18、。反射光柵又可分為平面反射光柵（或稱(chēng)閃耀光柵）和凹面反射光柵。b為狹縫寬度d為光柵常數(shù)，它等于狹縫寬度加兩狹縫之間的距離，即相鄰兩刻痕間的距離。為衍射角。i為入射角光柵的色散原理圖光柵會(huì)聚透鏡透鏡焦平面上的受光屏平面透射光柵 當(dāng)光以垂直方向照射光柵即i0，則 n=0，1，2， n稱(chēng)為干涉的級(jí)?？梢缘玫椒Q(chēng)為零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)、的光柵光譜。若入射光不是垂直地照射在光柵上，而是有一定的角度，則上式寫(xiě)為： 該式稱(chēng)為平面衍射光柵方程，簡(jiǎn)稱(chēng)光柵方程。反射型復(fù)制光柵，它是在平面玻璃上粘結(jié)上一定角度刻槽的鋁反射膜而制成的。鋁膜很薄(約0.11.5um)、很亮，故從外表看不出和一般的反射鏡有什么明顯的差異。光柵表

19、面的鋁膜質(zhì)地很松軟，極易擦傷，所以在維護(hù)時(shí)，嚴(yán)禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去觸摸，否則會(huì)造成永久性損壞。萬(wàn)一光柵上落上了灰塵，只能用吹氣球吹去。不同波長(zhǎng)的光具有不同的衍射角，兩者成比例關(guān)系。波長(zhǎng)長(zhǎng)者衍射角大，波長(zhǎng)短者衍射角小。因此，利用光柵可以把不同波長(zhǎng)的光分開(kāi)，這就是光柵的色散原理。閃耀光柵 光柵的寬度越大，總刻線數(shù)越多，分辨率越大。對(duì)同一線光譜而言，光柵的分辨率是常數(shù)，不隨波長(zhǎng)而變化。 i是入射角，是衍射角，是光柵刻痕角。反射面與光柵平面的夾角，稱(chēng)為閃耀角。3、濾光片在簡(jiǎn)易的比色計(jì)中，使用濾光片能夠獲得有限波長(zhǎng)范圍的光。濾光片分為吸收濾光片和干涉濾光片兩種。吸收濾光片由有色玻璃或內(nèi)夾在兩

20、玻璃片之間的有色染料的明膠所組成，這種濾光片適用于可見(jiàn)光區(qū)。干涉濾光片是根據(jù)光的干涉原理設(shè)計(jì)的，它是由透明的電解質(zhì)（如氟化鈣或氟化鎂），夾在兩塊內(nèi)側(cè)涂有一層半透明金屬（如銀）簿膜的玻璃或石英片之間所組成。電解質(zhì)的厚度必須嚴(yán)格控制。這種濾光片適用于紫外光區(qū)。偏離Beer定律的因素根據(jù)Beer定律，當(dāng)波長(zhǎng)和入射光強(qiáng)度一定時(shí)，吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C成正比。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，C與A之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過(guò)原點(diǎn)的直線。但實(shí)際工作中常常會(huì)出現(xiàn)偏離直線的情況，即偏離Beer定律的現(xiàn)象。導(dǎo)致偏離的主要因素有化學(xué)因素與光學(xué)因素。第三節(jié) 光度法的誤差3.1 化學(xué)因素通常只有當(dāng)溶液濃度小于0.01mo

21、lL的稀溶液時(shí)Beer定律才能成立。隨著溶液濃度的改變，溶液中吸光物質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合、溶劑化以及配合物組成等的變化，使吸光物質(zhì)存在形式發(fā)生變化，從而使吸光物質(zhì)對(duì)光吸收的選擇性和吸光強(qiáng)度也發(fā)生相應(yīng)的變化。 隨著濃度的增大，660nm處吸收峰減弱，而610 nm處吸收峰增強(qiáng)，吸收光譜形狀改變。由于離子濃度的變化，使吸光度與濃度成正比的關(guān)系發(fā)生偏離。例1：亞甲藍(lán)陽(yáng)離子水溶液的吸收光譜例2：重鉻酸鉀的水溶液有以下平衡：若溶液稀釋2倍，由于受稀釋平衡向右移動(dòng)的影響， Cr2O7 2-離子濃度不是減小2倍，Cr2O7 2- 離子濃度的減少明顯地多于2倍。Cr2O7 2- 、CrO4 2-兩

22、種離子在某一波長(zhǎng)處吸光強(qiáng)度相差較大，致使重鉻酸鉀水溶液吸光度的降低與濃度的降低不成正比而偏離Beer定律。若控制溶液的酸度，在強(qiáng)酸性條件下測(cè)定Cr2O7 2- ，或在強(qiáng)堿條件下測(cè)定Cr2O7 2- ，偏離Beer定律的現(xiàn)象可以避免。3.2 光學(xué)因素3.2.1 非單色光Beer定律只適用于單色光，而實(shí)際用于測(cè)量的是一定波長(zhǎng)范圍的復(fù)合光，由于吸光物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收能力不同，就導(dǎo)致了對(duì)Beer定律的偏離。例如，右圖所示的吸收光譜，用譜帶I所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行分析，造成的偏離就比較小。用譜帶所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行分析就會(huì)造成較大的偏離。通常選擇吸光物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。這樣不僅能保證測(cè)定有較高的

23、靈敏度，而且此處曲線較為平坦，吸光系數(shù)變化不大，對(duì)Beer定律的偏離程度就比較小。在保證一定光強(qiáng)的前提下，應(yīng)使用盡可能窄的帶寬寬度，同時(shí)應(yīng)盡量避免采用尖銳的吸收峰進(jìn)行定量分析。3.2.2 雜散光從單色光器得到的單色光中，還有一些不在譜帶范圍內(nèi)的與所需波長(zhǎng)相隔甚遠(yuǎn)的光，稱(chēng)為雜散光(stray light)。主要由儀器光學(xué)系統(tǒng)的缺陷或光學(xué)元件受灰塵、霉蝕的影響而引起。特別是在透光率很弱的情況下，雜散光的影響尤為顯著。雜散光Is常隨入射光強(qiáng)度I0的增大而增大。若供試品不吸收雜散光，(Is+I0)(It+Is)I0/It，A變小，為負(fù)偏離，供試品吸收雜散光，A增大，為正偏離。前一種情況在分析中常會(huì)遇到

24、。 設(shè)照射光強(qiáng)度為I0 ，透過(guò)光強(qiáng)度為It，雜散光強(qiáng)度為Is ，則觀察到的吸光度為：隨著儀器制造工藝的提高，絕大部分波長(zhǎng)內(nèi)雜散光的影響可忽略不計(jì)。但在接近紫外末端處，因在短波長(zhǎng)光源強(qiáng)度和檢測(cè)器靈敏度均減弱，雜散光的比例相對(duì)增大，測(cè)定時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假峰。如用鎢燈作為光源時(shí)，350-400nm波長(zhǎng)雜散光影響顯著；若用紫外光源時(shí)，220nm以下的雜散光迅速增大。3.2.3 散射光和反射光吸光質(zhì)點(diǎn)對(duì)入射光有散射作用，吸收池內(nèi)外界面之間入射光通過(guò)時(shí)又有反射作用。散射光和反射光均由入射光譜帶寬度內(nèi)的光產(chǎn)生，對(duì)透射光強(qiáng)度有直接影響。散射和反射作用致使透射光強(qiáng)度減弱。真溶液散射作用較弱，可用空白進(jìn)行補(bǔ)償?；鞚崛?/p>

25、液散射作用較強(qiáng)，一般不易制備相同的空白溶液，常使測(cè)得的吸光度偏離，分析中不容忽視。3.2.4 非平行光通過(guò)吸收池的光，一般都不是真正的平行光，傾斜光通過(guò)吸收池的實(shí)際光程將比垂直照射的平行光的光程長(zhǎng)。使厚度增大而影響測(cè)量值。這種測(cè)量時(shí)實(shí)際厚度的變異也是同一物質(zhì)用不同儀器測(cè)定吸光系數(shù)時(shí)，產(chǎn)生差異的主要原因之一。3.3 干擾的產(chǎn)生及其消除 干擾物質(zhì)的影響有以下幾種情況：干擾物質(zhì)本身有顏色或無(wú)色但與顯色劑形成有色化合物，在測(cè)定條件下也有吸收；在顯色條件下，干擾物質(zhì)水解，析出沉淀使溶液混濁，致使吸光度的測(cè)定無(wú)法進(jìn)行；與待測(cè)離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行完全。3.3.1 控制酸度根據(jù)配

26、合物的穩(wěn)定性不同，可以利用控制酸度的方法提高反應(yīng)的選擇性，保證主反應(yīng)進(jìn)行完全。例如，雙硫腺能與Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+、等十多種金屬離子形成有色配合物，其中與Hg2+生成的配合物最穩(wěn)定，在o.5mol/ml H2SO4介質(zhì)中仍能定量進(jìn)行，而上述其他離子在此條件下不發(fā)生反應(yīng)。3.3.2 選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿┦褂醚诒蝿┫蓴_是常用的有效方法。選取的條件是掩蔽劑不與待測(cè)離子作用；掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的配合物的顏色應(yīng)不干擾待測(cè)離子的測(cè)定。3.3.3 利用生成惰性配合物 例如鋼鐵中微量鈷的測(cè)定常用鈷試劑為顯色劑，但鈷試劑不僅與Co2+發(fā)生反應(yīng)，而且與Ni2+、Zn2+、Mn2

27、+、Fe2+、等都有反應(yīng)。鈷試劑與Co2+在弱酸性介質(zhì)中一旦完成反應(yīng)后，即使再用強(qiáng)酸酸化溶液，該配合物也不會(huì)分解。Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等與鈷試劑形成的配臺(tái)物在強(qiáng)酸介質(zhì)中很快分解，從而消除了上述離子的干擾，提高了反應(yīng)的選擇性。3.3.4 選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng) 例如在K2Cr2O7存在下測(cè)定KMnO4時(shí)不是選max(525nm)，而是選=545nm。這樣測(cè)定KMn04溶液的吸光度，K2Cr2O7就不干擾。3.3.5 選擇適宜的空白溶液空白溶液又叫參比溶液。空白溶液除用以校正儀器透光率100或吸光度為零，除作為測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)外，在中藥制劑分析中還用于消除干擾吸收。溶劑、試劑、器皿及

28、試樣本身都可能引入干擾因素。常見(jiàn)的空白溶液有：溶劑空白、試劑空白、試樣空白、不顯色空白、平行操作空白等。1、溶劑空白在測(cè)定入射光波長(zhǎng)下，溶液中只有被測(cè)組分對(duì)光有吸收，而顯色劑和其他組分對(duì)光無(wú)吸收，或雖有少許吸收，但所引起的測(cè)定誤差在允許范圍內(nèi)，在此情況下可用溶劑作為空白溶液。2、試劑空白相同條件下只是不加試樣溶液，依次加入各種試劑和溶劑所得到的溶液稱(chēng)為試劑空白溶液。適用于在測(cè)定條件下，顯色劑或其他試劑、溶劑等對(duì)待測(cè)組分的測(cè)定有干擾的情況。3、試樣空白與顯色反應(yīng)同樣的條件取同量試樣溶液，不加顯色劑所制備的溶液稱(chēng)為試樣空白溶液。適用于試樣基體有色并在測(cè)定條件下有吸收，而顯色劑溶液無(wú)干擾吸收也不與試

29、樣基體顯色的情況。4、不顯色空白某些顯色反應(yīng)，當(dāng)改變?cè)噭┘尤腠樞蚧蚰骋徊僮鳎ㄈ缂訜岣臑椴患訜幔r(shí)，可使被測(cè)組分與顯色劑的顯色反應(yīng)不發(fā)生，這樣配制的溶液稱(chēng)為不顯色空白溶液。這種空白能夠同時(shí)消除試樣基體和試劑的干擾。5、平行操作空白如果容器、器材、溶劑、試劑以及環(huán)境可能帶入被測(cè)組分或干擾組分時(shí)可采用不含被測(cè)組分的試樣基體作為空白試樣，與試樣在完全相同條件下平行操作，然后用此溶液為空白溶液，這種空白可當(dāng)作一個(gè)試樣來(lái)處理，測(cè)得的結(jié)果稱(chēng)為空白值，應(yīng)從試樣測(cè)得結(jié)果中減去。3.3.6 分離若上述方法不宜采用時(shí)，也可以采用預(yù)先分離的方法，如沉淀、萃取、離子交換、蒸發(fā)和蒸餾以及色譜分離法等。此外，還可以利用化學(xué)

30、計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)定。4.1 定性分析4.2 定量分析4.3 分光光度法的具體應(yīng)用第四節(jié) 分光光度法的應(yīng)用1、比較吸收光譜曲線。2、比較最大吸收波長(zhǎng)。3、比較吸光度比值。4.1 定性分析定性分析缺點(diǎn)：紫外和可見(jiàn)光譜的特征吸收帶是主要的定性依據(jù)，但在定性分析上的應(yīng)用是有限的，因?yàn)槠湮諑Ш軐挘狈?xì)結(jié)構(gòu)的特征，在定性方面不如紅外吸收光譜。如果只有一兩個(gè)發(fā)色團(tuán)相同，其它部分的結(jié)構(gòu)略有不同，對(duì)紫外和可見(jiàn)光譜影響變化不大，往往具有十分接近的吸收光譜。所以在鑒定化合物時(shí)要注意，即使是光譜相同，未必是同一種化合物，要采用其它分析方法配合進(jìn)一步鑒定。 4.2 定量分析定量分析的依據(jù)是比耳定律、在液

31、層厚度一定時(shí)，溶液的濃度與吸光度要成正比關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線法、對(duì)比法、標(biāo)準(zhǔn)增量法，多組分混合物分析法，雙波長(zhǎng)分光光度法。4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過(guò)程顯色后，分別測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度。4.2.2 對(duì)比法先配制一種己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液C標(biāo)，測(cè)其吸光度為A標(biāo)，再在相同條件下測(cè)得樣品溶液的吸光度為A樣，根據(jù)下列公式求得樣品濃度。此法可不做標(biāo)準(zhǔn)曲線但要求溶液中的待測(cè)物質(zhì)能?chē)?yán)格符合光的吸收定律，而且樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值較為接近這種方法的測(cè)定誤差比標(biāo)準(zhǔn)曲線法要大一些。

32、4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)增量法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法使未知樣與標(biāo)準(zhǔn)樣保持一致，在實(shí)際中并不是總能做到的， 采用增量法可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)。方法是將未知樣分成體積相同若干份，除其中一份不加已知被測(cè)組分外，其余都加，在合適條件下測(cè)定如未知樣不含被測(cè)組分，吸光值A(chǔ)應(yīng)為零，曲線過(guò)原點(diǎn)。但實(shí)際沒(méi)過(guò)原點(diǎn)，上截矩A1，校正后，曲線延長(zhǎng)至OO濃度為Cx如圖。此法還可以檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程的系統(tǒng)誤差設(shè)樣品中校測(cè)組分真實(shí)含量為Cx實(shí)驗(yàn)值為C1，在樣品中增加已知量b時(shí)，測(cè)得實(shí)驗(yàn)值為C2，實(shí)驗(yàn)過(guò)程系統(tǒng)誤差為k則：必要條件是當(dāng)被測(cè)組分含量的變化時(shí)K不隨其改變。4.2.4 多組分混合物分析法當(dāng)樣品溶液中含有二種以上組分時(shí)，由于組分之間吸收峰相互干擾

33、情況不同，計(jì)算方式也有所不同。 吸收光譜不重疊 吸收光譜重疊 吸收光譜不重疊。在1處B無(wú)吸收，在2處A無(wú)吸收，所以可分別在1及2處測(cè)定組分A和B的濃反，直接應(yīng)用比爾定律計(jì)算。吸收光譜重疊如果二組分各自的吸收光譜互相重疊，則混合物的吸收光譜為二組分各自吸收光譜的加和，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。A1= a1bca + b1bcb A2= a2bca + b2bcb 4.2.5 雙波長(zhǎng)分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長(zhǎng)1處的吸光度A1作為參比，來(lái)消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性

34、、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。 A A2 A1 (2 1)b c兩波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度差值A(chǔ)與待測(cè)組分濃度成正比。1和2分別表示待測(cè)組分在1和2處的摩爾吸光系數(shù)。雙波長(zhǎng)分光光度法 關(guān)鍵問(wèn)題測(cè)量波長(zhǎng)2和參比波長(zhǎng)1的選擇與組合以兩組分x和y的雙波長(zhǎng)法測(cè)定為例：設(shè)：x為待測(cè)組分，y為干擾組分，二者的吸光度差分別為: Ax和Ay。則該體系的總吸光度差A(yù)x+y為： Ax+y = A x + A y如何選擇波長(zhǎng)1 、2有一定的要求。波長(zhǎng)組合1 、2的基本要求是： 選定的波長(zhǎng)1和2處，干擾 組分應(yīng)具有相同吸光度，即： Ay = A y2 - A y1 = 0 故：Ax+y = A x=(x2-x1)

35、bcx此時(shí)：測(cè)得的吸光度差A(yù)只與待測(cè)組分x的濃度呈線性關(guān)系，而與干擾組分y無(wú)關(guān)。若x為干擾組分，則也可用同樣的方法測(cè)定y組分。 在選定的兩個(gè)波長(zhǎng)1和2處待測(cè)組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。采用作圖法選擇符合上述兩個(gè)條件的波長(zhǎng)組合。4.3 分光光度法的具體應(yīng)用4.3.1 蛋白質(zhì)測(cè)定 雙縮脲法 考馬斯亮藍(lán)G250染色法4.3.2 核酸測(cè)定4.3.3 葉綠素的測(cè)定4.3.1 蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)的分析是生物化學(xué)和其它生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)、臨床診斷等領(lǐng)域最常涉及到的分析檢測(cè)手段。由于蛋白質(zhì)種類(lèi)很多，分子組成、結(jié)構(gòu)、分子量差別很大，功能各異，因此分析蛋白質(zhì)含且的方法很多，各有其持點(diǎn)。分光光度法是目前最常用的一

36、種方法(1) 雙縮脲法利用雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)與二價(jià)銅離子在堿性溶液中形成紫色絡(luò)合物，最大吸收波長(zhǎng)在540nm，可測(cè)定含有10-1200 ug/mL蛋白質(zhì)樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系和重復(fù)性好雙縮脲試劑：硫酸銅1.5g，酒石酸鉀鈉6g，碘化鉀1g，溶于適量水，攪拌狀態(tài)下加入300mL 10氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000mL，在塑料瓶中貯存標(biāo)淮曲線繪制及樣品測(cè)定：在試管中分別加入0.0，0.1，0.2，0.3、0.4，0.5，0.6mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，用水補(bǔ)足到0.6ml，另取一份0.6mL樣品，上述溶液中分別加入2.4mL雙縮脲試劑，混均后室溫放置15min，540nm處測(cè)定(2) 考馬斯亮藍(lán)G250

37、染色法考馬斯亮藍(lán)G250，在酸性溶液中為棕紅色，它和蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合后產(chǎn)生顏色反應(yīng)呈藍(lán)色。在595nm處有最大光吸收，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸收值成正比，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為l-140ug/mL，幾乎無(wú)測(cè)定干擾，靈敏度較高。配制顯色劑：將100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶解于50mL 95的乙醇中。加入100mL 85的磷酸，加水稀釋至1L。 配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：在試管中分別加入含0，10，20，30，40，50，60ug的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，加水至60uL加3mL染色液，另取樣品液也加3mL染色液，混勻后室溫放置15min。595nm處測(cè)定。4.3.2 核酸測(cè)定由于核酸和蛋白質(zhì)通常

38、(結(jié)合在一起)以核蛋白的形式存在，所以在提純核酸的過(guò)程中要測(cè)定其中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量。通過(guò)兩個(gè)波長(zhǎng)(260nm/280nm)的吸收讀數(shù)比率和空白的校正，即可估算核酸的純度。DNA比值為1.8，RNA比值為2.0。對(duì)核酸來(lái)說(shuō)，260nm/280nm的比值越小，說(shuō)明蛋白雜質(zhì)越多，兩個(gè)波長(zhǎng)吸收比率小于所規(guī)定的最小值，則核酸純度不符合要求。常涉及到用于測(cè)定核酸樣品的波長(zhǎng)有4個(gè) 230nm，肽鍵的吸收波長(zhǎng)，用此波長(zhǎng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的含量比280nm處更靈敏但常用緩沖液(如Tris等)對(duì)測(cè)定有干擾。280nm，蛋白質(zhì)中芳香族氨基鼓的吸收波長(zhǎng)，由于干擾少，經(jīng)常使用。260nm，大多數(shù)單核苷酸的最大吸收波長(zhǎng)均在260

39、nm附近，用來(lái)檢測(cè)核酸的含量。320nm，用于本底校正，核酸和蛋白質(zhì)在此波長(zhǎng)下無(wú)吸收，一些干擾因素（如散射光）可產(chǎn)生吸收。為使用方便起見(jiàn)，將上述4種波長(zhǎng)按不同組合編成四個(gè)固定的指定參數(shù)方法。核酸測(cè)定的四種指定的參數(shù)法：(1)測(cè)定260nm/280nm及280nm/260nm的比率。(2)測(cè)定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，背景校正波長(zhǎng)320nm。(3)測(cè)定230nm/280nm及260nm/230nm的比率，背景校正波長(zhǎng)320nm。(4)測(cè)定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，用Warburg和Christian系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)和核酸濃度。核酸中的嘌呤、嘧

40、啶、蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸都有共軛雙鍵，分別在波長(zhǎng)260nm、280nm處有紫外吸收。由于各種核酸、蛋白的差異很大，為了更準(zhǔn)確的測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度，用經(jīng)典濃度公式，即Warburg和Christian濃度公式測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)(ug/mL)1552A280757.3A260核酸（ug/mL）62.9A260 36A2804.3.3 葉綠素的測(cè)定將2g鮮重葉片放在干凈研缽內(nèi)，加40mL 80丙酮，把組織研磨勻漿，研磨大約3min，小心地把綠色液體轉(zhuǎn)移到一個(gè)墊有濾紙的漏斗內(nèi)，當(dāng)過(guò)濾提取液時(shí)(抽濾)，用另外30mL 80丙酮重復(fù)研磨所剩物成勻漿，3-4min之后，如前一樣將第二次提取液

41、過(guò)濾到含第一次提取液的燒瓶里。最后用80丙酮將濾液定容至100mL。葉綠素有葉綠素a和葉綠素b，它們分別有持征吸收光譜。在丙酮提取液中，葉綠素a在波長(zhǎng)663nm；葉綠素b在波長(zhǎng)645nm有吸收蜂。式中Ca、Cb分別為葉綠素a及葉綠素b的濃度，為了便于區(qū)別用d代表光徑。當(dāng)d=1.0cm，C取mg/mL為單位時(shí)，其值已由實(shí)驗(yàn)測(cè)定，分別為： a1=82.09 b1=9.24 a2=16.75 b2=45.6葉綠素提取液的消光度在兩種波長(zhǎng)下分別為A1及A2，它們可寫(xiě)為：可得到每克葉片中所含葉綠素的毫克數(shù):W為葉片的鮮重、單位為克V是80丙酮-葉綠素提取液的最終體積，單位為毫升測(cè)量時(shí)以80丙酮為空白對(duì)照

42、，比色池的光徑為10mm。另外，葉綠素a、b的等吸收點(diǎn)在652nm，故可在652nm測(cè)定。4.3.4 酶動(dòng)力學(xué)研究分光光度法是酶動(dòng)力學(xué)研究最有效的工具。通過(guò)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究，有助于了解酶與底物的結(jié)合機(jī)制和作用方式、酶的底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系符合米氏理論。第五節(jié) 原子吸收分光光度法1802年，發(fā)現(xiàn)原子吸收現(xiàn)象：原子蒸氣對(duì)其原子共振輻射吸收的現(xiàn)象；1955年，澳大利亞物理學(xué)家 Walsh A（瓦爾西）發(fā)表了著名論文：原子吸收光譜法在分析化學(xué)中的應(yīng)用，奠定了原子吸收光譜法的基礎(chǔ)，之后迅速發(fā)展。原子吸收光譜法特點(diǎn)：(1) 檢出限低，10-1010-14 g；(2) 準(zhǔn)確度高，誤差在1%5%；

43、(3) 選擇性高，一般情況下共存元素不干擾；(4) 應(yīng)用廣，可測(cè)定各種樣品中70多個(gè)元素。原子吸收光譜法局限性：(1)難熔元素、非金屬元素測(cè)定困難(2)不能同時(shí)多元素第六節(jié) 熒光分析法某些物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后，能立即放出能量較低（亦即波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的光。 當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱(chēng)熒光超過(guò)此限度即稱(chēng)為磷光。 熒光的波長(zhǎng)與被照射物質(zhì)有關(guān)。以紫外線作激發(fā)光源，所發(fā)射的熒光常在可見(jiàn)光區(qū)。測(cè)量熒光強(qiáng)度以確定物質(zhì)含量的方法叫做熒光分析法，所使用的儀器叫熒光計(jì)。6.1 原理設(shè)IF為熒光強(qiáng)度；I0入射紫外線強(qiáng)度；It為透過(guò)溶液后紫外線強(qiáng)度；Ia為溶液吸收紫外線； 則：Ia=I0-ItC為溶液中被測(cè)物質(zhì)的濃度；l為溶液層的厚度。 據(jù)朗