1、雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試：結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報(bào)告基因測(cè)試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí)，通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來 減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報(bào)告基因（比如CAT, 0-Gal,GUS） 不夠便利，因?yàn)楦髯缘臏y(cè)試化學(xué)，處理要求，檢測(cè)特點(diǎn)存在差異。Promega提供一種先進(jìn)的雙報(bào)告基因技術(shù)，結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測(cè) 試和海洋腔腸熒光素酶測(cè)試。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)，結(jié)合pRL 載體系統(tǒng)，表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進(jìn)行雙 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試，快速，靈敏，簡(jiǎn)便。系統(tǒng)還提供PLB裂解液， 用來裂解在多孔板中培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞，不需操作單個(gè)樣品。對(duì)于正在 使用螢

2、火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報(bào)告基因 測(cè)試系統(tǒng)將使他們立即體會(huì)到該系統(tǒng)的便利。介紹雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測(cè)，通常一 個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化。檢測(cè)基因 表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來姓時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的 載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對(duì)照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào) 告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子,研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告 基因表達(dá)活力的相對(duì)改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶 聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照,使測(cè) 試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)

3、準(zhǔn)確性， 比如，培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)日和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。使用螢火蟲熒光素酶，結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT), p -半乳糖 苷酶(。-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的雙報(bào)告基因，近幾年已普 遍使用。但這些雙報(bào)告基因組合削弱了熒光素酶操作的優(yōu)勢(shì)，比如 熒光素酶測(cè)試和定量可在幾秒鐘內(nèi)進(jìn)行，但CAT，p -Gal和GUS測(cè)試 法，則在定量前需要長(zhǎng)時(shí)間的保溫。另外，這些報(bào)告基因受限于它們 的靈敏度和線性應(yīng)答范圍，必須注意不要超過這些范圍，內(nèi)源性細(xì) 胞活力也會(huì)干擾這類報(bào)告基因的使用。許多類型的細(xì)胞有內(nèi)源p -Gal 或GUS表達(dá)，不利于準(zhǔn)確定量報(bào)告基因表達(dá)，胞內(nèi)去乙酰酶活力干 擾CAT活

4、力測(cè)試。盡管在高溫下預(yù)處理細(xì)胞裂解液(1，2)，會(huì)降低內(nèi) 源性p -Gal和CAT測(cè)試的干擾，但這些處理也會(huì)快速失活熒光素酶。 因此,在此類雙報(bào)告基因檢測(cè)中，必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞裂解液。理想的雙報(bào)告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具 有的速度，靈敏和線性范圍對(duì)同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測(cè)定。 這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因，如 CAT, p -Gal和GUS是不可能的，由于它們 測(cè)試化學(xué)，處理要求所固有的局限。相反，結(jié)合螢火蟲(Photinus pyralis )和海洋腔腸(Renilla reniformis)雙熒光素酶，Promega的雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試(DLR)系統(tǒng)可

5、滿足這些要求， 在單管中完成這些測(cè)試。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試化學(xué)熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發(fā)光報(bào)告基因的卓越的測(cè) 試特點(diǎn)，但它們?cè)谶M(jìn)化上的起源不同，因此，具有不同的酶學(xué)結(jié) 構(gòu)和底物要求。這些差別用來發(fā)展了 DLR測(cè)試化學(xué)，選擇性地區(qū)別 這兩種發(fā)光報(bào)告基因的活力。螢火蟲熒光素酶是一個(gè)61kDa單亞基 蛋白質(zhì)，酶活力不需翻譯后修飾(3,4),在翻譯后即可作為遺傳報(bào) 告基因。在ATP,Mg 2+和0 2存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應(yīng) 發(fā)光(圖1)。在常規(guī)反應(yīng)條件下，熒光素的氧化發(fā)生時(shí)，以熒 光素-AMP作為中間體,轉(zhuǎn)換非常緩慢。結(jié)果，在底物和酶混合 后，測(cè)試化學(xué)產(chǎn)生閃爍的光，并迅速衰減。專

6、利化的測(cè)試試劑， 定量螢火蟲熒光素酶活力，摻入了輔酶A(CoA),增強(qiáng)快速酶轉(zhuǎn)換 來提高反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(5),導(dǎo)致持續(xù)的閃爍發(fā)光信號(hào)(圖2)。圖1由螢火蟲和Renilla熒光素酶催化的生物發(fā)光 海洋腔腸熒光素酶，一個(gè)36 kDa單亞基蛋白質(zhì)，純化自天然來源的Renilla reniformis（6），含有3%的碳水化合物，但是和螢火蟲熒光素酶一樣，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報(bào)告基 因。海洋腔腸熒光素酶所催化的發(fā)光反應(yīng)，利用O 2和海樣腔腸熒 光素（coelenterazine）（圖1）。當(dāng)用DLR測(cè)試化學(xué)作實(shí)驗(yàn)時(shí)，海洋 腔腸熒光素酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生閃爍型發(fā)光信號(hào)，在檢測(cè)過程中緩慢

7、地衰減（圖2）。在DLR測(cè)試系統(tǒng)中，用單個(gè)裂解液分步測(cè)定螢火蟲和海洋腔腸熒光 素酶活力。在完成螢火蟲熒光素酶活力（實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因）的測(cè)定后， 螢火蟲發(fā)光被快速湮滅，并同時(shí)激活海洋腔腸熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)（ 對(duì)照?qǐng)?bào)告基因）。因此，DLR測(cè)試系統(tǒng)整合了兩個(gè)測(cè)試化學(xué)，對(duì)共 表達(dá)的兩個(gè)報(bào)告基因作快速地定量，酶來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液，或無細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。螢火蟲熒光素酶測(cè)試的線性范圍延伸達(dá)酶濃度的8個(gè)數(shù)量級(jí)，可 測(cè)定W1fg （大約10 -20摩爾）的實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因酶（圖3A）。用雙熒光 素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)，海洋腔腸熒光素酶的線性范圍達(dá)酶濃度的 7個(gè)數(shù)量級(jí)，較低的底限是W 10fg （大約3X10 -19摩

8、爾）的對(duì)照?qǐng)?bào) 告基因酶（圖3B），并且這兩個(gè)酶的特異活力相似。圖2用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試由螢火蟲和Renilla熒光素酶產(chǎn)生 的發(fā)光。CHO細(xì)胞（1X10 6 /60mm培養(yǎng)板）共轉(zhuǎn)染pGL3Control和pRL SV40載體DNA。細(xì)胞用PBS洗滌后，加入400口 l PLB 制成裂解液。將20p l小量細(xì)胞裂解液和100口 l熒光素酶測(cè)試試劑 II（LARII）混合，螢火蟲熒光素酶的活力立即用熒光照度儀檢測(cè)（細(xì)線 示蹤）。100p l Stop &Glo TM試劑加入到熒光照度儀管中，湮滅螢 火蟲熒光素酶反應(yīng)，同時(shí)激活Renilla熒光素酶反應(yīng)，并立即檢測(cè) Renilla熒光素酶的活力

9、（粗線示蹤）。Turner Designs型號(hào)20/20 熒光照度儀配有計(jì)算機(jī)用來示蹤熒光發(fā)射，12秒內(nèi)完成兩次測(cè)試。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)的方式定量?jī)蓚€(gè)報(bào)告基因熒光素酶的發(fā)光信號(hào)，可在制備裂解液后立刻 進(jìn)行，不需將樣品分成小組分或作額外的處理。因海洋腔腸和螢火 蟲熒光素酶均呈現(xiàn)閃爍型反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，作雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試不 需要有試劑注射器的熒光照度儀。通常DLR測(cè)試，大約需要30秒鐘完成，如圖4所說明。起始螢 火蟲熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試時(shí)，將一份裂解產(chǎn)物和熒光素酶測(cè)試試劑 II (LAR II)混合。在完成螢火蟲熒光素酶測(cè)試時(shí)，此時(shí)螢火蟲發(fā)光 被湮滅，同時(shí)激活海洋腔腸熒光素酶的發(fā)光，加入S

10、top & Glo TM試 劑到樣品管。在1秒鐘內(nèi)，Stop & Glo TM試劑湮滅大于10 5滴度 螢火蟲反應(yīng)的發(fā)光信號(hào)(圖5)，并同時(shí)激活海洋腔腸熒光素酶。45、*woeijnctiW蟆第M ( to 1JM0JW05榮洪WTO圖3螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的線性范圍。純 化的螢火蟲和Renilla熒光素酶連續(xù)地用含1mg/ml BSA的1XPLB稀 釋，配有計(jì)算機(jī)的Turner Designs熒光照度儀用來檢測(cè)10秒鐘的總 熒光，在最初2秒的預(yù)讀延遲后。直接檢測(cè)高濃度的兩種熒光素酶的 發(fā)光反應(yīng)時(shí)，在熒光照度儀的樣品室中加入中性密度濾光片。在含 10fg和100fg的

11、Renilla熒光素酶反應(yīng)中測(cè)試發(fā)光，需減去來自海 洋腔腸熒光素自發(fā)光的背景信號(hào)。兩種熒光素酶的發(fā)光活力對(duì)各自的 測(cè)試變化濃度作圖。100 4dSlop& W 試精fit火蟲會(huì)免素卜圖4用手工熒光照度儀或配有試劑加樣器的熒光照度儀的雙熒光素 酶測(cè)試方式。如熒光照度儀配有兩個(gè)加樣器，將裂解液預(yù)先分裝到熒 光照度儀的管子中，隨后按序自動(dòng)加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 試劑。PLB裂解液PLB裂解液(Passive Lysis Buffer)，經(jīng)特別設(shè)計(jì)可有效裂解培養(yǎng) 的哺乳細(xì)胞，而不必刮下貼壁細(xì)胞或作凍融循環(huán)。盡管PLB設(shè)

12、計(jì)應(yīng)用 于被動(dòng)裂解過程中，但它可靠的裂解效果同樣有益于使用常規(guī)處理方 法制作的裂解液。無論使用何種裂解方法，對(duì)培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞而言， 釋放到PLB裂解液中的螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶報(bào)告基因酶是定 量和可靠的（圖6）。被動(dòng)裂解液的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)，是可以抑制低水 平的非酶促發(fā)光（自發(fā)光），這是海洋腔腸熒光素在水溶液中的固有 特點(diǎn)。通常用來制備細(xì)胞裂解液的試劑可增強(qiáng)海洋腔腸熒光素自發(fā) 光，包括Triton? X-100, Promega的細(xì)胞培養(yǎng)裂解試？（CCLR）和報(bào) 告基因裂解試劑（RLB），這些試劑還會(huì)顯著抑制海洋腔腸熒光素酶的 發(fā)光反應(yīng)。PLB經(jīng)特別設(shè)計(jì)用來最大地增強(qiáng)熒光素酶活力，使自發(fā)光 減弱

13、到最低，可提供最優(yōu)的測(cè)試靈敏度，定量很低水平的海洋腔腸熒 光素酶。另外，PLB抑制發(fā)泡，非常適合高通量應(yīng)用，可用于自動(dòng)化 系統(tǒng)中將培養(yǎng)在多孔板中的細(xì)胞組制備成裂解液并測(cè)試。Kxarc-圖5雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)湮滅螢火蟲熒光素酶發(fā)光和激活 Renilla熒光素酶發(fā)光。CHO細(xì)胞裂解液有共轉(zhuǎn)染pGL3 -Control和 pRL SV40載體DNA，按圖2描述的方法制備。螢火蟲熒光素酶（報(bào)告 基因1）和Renilla熒光素酶（報(bào)告基因2）活力檢測(cè)在10秒內(nèi)完成，最初有2秒的預(yù)讀延遲。為了顯示Stop & Glo TM試劑湮滅報(bào) 告基因1的高效率，加入等體積的Stop & Glo TM試劑（缺

14、少海洋 腔腸熒光素?zé)o法激活Renilla熒光素酶反應(yīng)），螢火蟲熒光素酶發(fā)光 被湮滅而又不激活Renilla熒光素酶發(fā)光。在這一實(shí)驗(yàn)中，湮滅螢火 蟲熒光素酶反應(yīng)的殘留發(fā)光，小于未湮滅反應(yīng)值的0.0004%圖6用PLB裂解哺乳細(xì)胞的高效率和被動(dòng)或主動(dòng)裂解方法。用 pGL3-Control和pRL-SV40載體DNA共轉(zhuǎn)染圖示的培養(yǎng)哺乳細(xì)胞，制 備裂解液時(shí)，向貼壁細(xì)胞加入PLB，溫和搖動(dòng)培養(yǎng)液達(dá)15分鐘（被 動(dòng)細(xì)胞裂解)，或從培養(yǎng)板中刮下貼壁細(xì)胞，在-80笆進(jìn)行1次凍/融 循環(huán)(主動(dòng)細(xì)胞裂解)。螢火蟲和Renilla熒光素酶活力用DLR方法確 定，如圖4所示。為了便于比較，報(bào)告基因活力用主動(dòng)裂解方法

15、對(duì)每 種細(xì)胞進(jìn)行歸一化。圖A：螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因活力。圖B： Renilla熒光素酶報(bào)告基因活力。海洋腔腸熒光素酶對(duì)照載體pRL系列設(shè)計(jì)的pRL載體系列可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，組成型地表達(dá)海洋腔 腸熒光素酶。這些載體含有克隆自Renilla reniformis(7)海洋腔 腸熒光素酶的cDNA (R luc )，在R luc基因中導(dǎo)入了 3個(gè)堿基替換， 消除了內(nèi)Bgl II, Bam H I和Nar I酶切位點(diǎn)，這些突變不造成海 洋腔腸熒光素酶表達(dá)的氨基酸序列的改變。提供的pRL載體有幾種啟 動(dòng)子構(gòu)型，可同螢火蟲熒光素酶載體組合，作為報(bào)告基因活力的內(nèi) 對(duì)照。pRL-TK載體pRL-TK (圖

16、9)，在Rluc上游含有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶 (HSV-TK)的啟動(dòng)子區(qū)域。HSV-TK啟動(dòng)子在胚胎和成熟的哺乳組織細(xì) 胞中，可低水平和組成型地表達(dá)(8, 9)。pRL-SV40載體pRL- SV40含SV40早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域，在多種細(xì)胞中，可高強(qiáng)度、組成型表達(dá)Rluc。載體pRL- 40還含有SV40的復(fù)制起始 區(qū)，在諸如COS-1或COS-7細(xì)胞中（10），可瞬時(shí)、附加體式地復(fù)制， 表達(dá)SV40大抗原。pRL-CMV載體pRL-CMV含CMV早早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域，在多種細(xì)胞類 型中，可高強(qiáng)度、組成型表達(dá)Rluc。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，CMV增強(qiáng)子/ 啟動(dòng)子具有泛主特點(diǎn)，在檢測(cè)的28

17、種小鼠組織中，24種有轉(zhuǎn)錄活 力。CCLA袍白Pl_&pRL-Null載體pRL-null無真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，在Rluc上游有一些單 一酶切位點(diǎn)，可提供最大靈活性來克隆所需的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)海洋 腔腸熒光素酶的表達(dá)。圖9所顯示的pRL-TK載體代表了 pRL載體所共有的特點(diǎn)，在每 個(gè)pRL載體的指定啟動(dòng)子的緊下游是一個(gè)嵌合的內(nèi)含子，可提供海洋 腔腸熒光素酶的增強(qiáng)表達(dá)。內(nèi)含子由人P -珠蛋白質(zhì)內(nèi)含子1的5- 供體剪切位點(diǎn)和免疫球蛋白基因重鏈可變區(qū)域的分枝點(diǎn)和3-受體 剪切位點(diǎn)組成(12)。供體和受體剪切位點(diǎn)、分枝點(diǎn)的序列均作了改變 以匹配最適剪切位點(diǎn)的共有序列(3)。在Rluc的緊上游是T

18、7啟動(dòng)子 序列，可在體外合成海洋腔腸熒光素酶的轉(zhuǎn)錄物Rluc的下游是SV40 晚期poly (A)序列，提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和mRNA多腺苷酸化(14)。 載體含有原核的復(fù)制起始區(qū)和。-內(nèi)酰胺酶基因，可在大腸桿菌中選 擇質(zhì)粒的擴(kuò)增。圖8用Passive Lysis Buffer制備細(xì)胞裂解物中螢火蟲和Renilla 熒光素酶的穩(wěn)定性。用pGL3-Control和pRL-SV40載體DNA共轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)6孔板中的CHO細(xì)胞(2.5 X10 5細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)30 小時(shí)后，將培養(yǎng)液吸干，每孔中的附著細(xì)胞用PBS洗滌一次。制備裂 解液時(shí)加入500口 l Passive Lysis Buffer到每

19、一個(gè)培養(yǎng)板中，在室 溫溫和地震蕩15分鐘。立即測(cè)試小組份的每一種裂解物中螢火蟲和Renilla熒光素酶活力，然后分裝，保存在22C（室溫）、4C,或-20C。 保存的樣品在指示的時(shí)間間隔內(nèi)重新測(cè)試。測(cè)試按圖5所描述的方法 進(jìn)行，每一個(gè)方框代表3個(gè)重復(fù)的細(xì)胞裂解物，作2次重復(fù)測(cè)試的均 值。Ivecur i：4.04SbpSV岫切4*心網(wǎng)l八y 圖9 pRL-TK載體的環(huán)形圖。附加描述：內(nèi)含子的位置，Rluc，編 碼Renilla熒光素酶的cDNA，Ampr,在E.coli中編碼氨芐抗性，ori, 在E.coli中質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)。Rluc和Amp r基因中的箭頭表示轉(zhuǎn)錄 的方向。小結(jié)在雙遺傳報(bào)告基

20、因的應(yīng)用中，一個(gè)報(bào)告基因活力的改變，與基因表達(dá) 的特定實(shí)驗(yàn)條件相關(guān)，而第二個(gè)報(bào)告基因的組成性活力提供了內(nèi)對(duì) 照，使實(shí)驗(yàn)值可以規(guī)一化。Promega的新的雙報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)， 在單管中測(cè)試兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因，此兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因具有 兼容的化學(xué)特性、操作條件、速度、靈敏度、線性范圍、和儀器需要。 熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶測(cè)試的組合，匹配pRL載體，提供了雙遺 傳報(bào)告基因應(yīng)用的理想測(cè)試系統(tǒng)。使用標(biāo)準(zhǔn)的手工熒光照度儀可在 30秒內(nèi)完成測(cè)試。特別設(shè)計(jì)的新的被動(dòng)裂解液，可快速、高效地將 培養(yǎng)在多孔板中的細(xì)胞裂解，并使螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶具有最 適測(cè)試靈敏度和穩(wěn)定性。雙報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)在體內(nèi)報(bào)告基因應(yīng)用的 優(yōu)勢(shì)，也同樣體現(xiàn)在無細(xì)胞系統(tǒng)的應(yīng)用，比如體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。參考文獻(xiàn)Ginot, F. et al. (1989) Eur. J. Biochem. 180, 289.Young, D. C. et al .(1993) Anal. Biochem. 215, 24.de Wet, J