1、南昌大學實驗報告胡蘿卜愈傷組織誘導姓名：學院：專業(yè)：班級：學號：胡蘿卜愈傷組織誘導實驗一母液的配制與保存一、實驗目的1學習母夜的配制方法和母液的保存方式。2.熟悉掌握制備母液的操作。 二、實驗原理培養(yǎng)基中提供植物生長所需的營養(yǎng)成分，才能滿足植物正常的生長發(fā)育的需求。主要包括水分、有機物質、鹽類，而配制母液時將其分為大量、微量、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、有機和肌醇分別配制。配谿培養(yǎng)基時，為了使用方便和用量準確，通常采用母液法進行配谿，即按培養(yǎng)基配方中各試劑的用量，擴大若干倍后再準確稱量分別先配制成一系列的母液谿于冰箱中保存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配谿即可。三、實驗材料、試劑和儀器設備.試劑NH4N

2、O3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2 2H2O ,MgSO4 7H2O,FeSO4 7H2O Na2-EDTA, MnSO4 4H2O,ZnSO4 7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4 2H2OCuSO4 5H2O,CoCl2 6H2O,肌醇，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸毗哆醇，煙酸，蒸儲水。.儀器設備電子天平，燒杯（50ml、100ml、500ml ）量筒（1000ml、100ml、25ml ）,容量瓶（1000ml、 500ml、100ml）,移液管（10ml, 5ml , 1ml）試劑瓶，玻璃棒數(shù)支，藥芍，稱量紙等。 四、實驗步驟 1、計算：計算各化學成分所需要的量。大量、微

3、量和鹽類按擴大50倍，定容500ml的配制計算。有機和肌醇按擴大100倍，定容200ml的配制計算。計算后制成配方表。 2、制定標簽：裁取 7張適當大小的牛皮紙，用鉛筆寫上 MS,種類，并標明此類母 液所含物質，質量，定容體積，擴大倍數(shù)吸取量，制備人，制備日期。3、大量元素母液的配制：先用量筒量取 300ml蒸儲水放入500ml燒杯中，按照配方表中用量依次分別稱?。篘H4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 ,待第一種化合物完全溶解后再加入第二種化合物，溶解過程用玻璃棒攪拌，當最后一種化合物完全溶解后，將溶液轉移至 500ml容量瓶中，并用蒸儲水將燒杯和玻璃棒洗滌3次，每次約50ml,而后用蒸

4、儲水定容至500ml ,然后轉移至細口試劑瓶中，貼上標簽，并谿于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?、微量元素母液的配制按照配方表中用量用電子天平依次稱 取 MnSO4 4H2O, ZnSO4 7H2O , H3BO3, KI, Na2MoO4 2H2O 。 CuSO4 5H2O 和CoCl2 6H2O先稀釋后用移液管吸取，按制備母液I的方法逐個溶 解，轉移至容量瓶中，/ 5洗滌燒杯，然后定容至500ml ,轉入細口試劑瓶中， 貼上標簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)， 配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、鐵鹽母液的制備 把FeSO4 7H2O和Na2-EDTA分別谿于適量蒸儲水中，加熱攪拌使 之完全溶解，

5、保持加熱，把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并攪拌，接近沸騰時停止加熱，冷卻后調PH到5.5 ,將溶液轉移至500ml容量瓶中，洗滌后用蒸儲水定容至 500ml ,轉入 細口試 劑瓶中，用力振蕩12min ,貼上標簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、有機化合物母液的制備按配方表中用量依次稱?。蝴}酸硫胺素，鹽酸口比哆酉I,煙酸，甘氨酸，用蒸儲水溶解后，定容 200ml轉入細口試劑瓶中，貼上標簽，注明母液名稱，放大倍 數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、植物生長物質母液制備 NAA母液:準確稱取10mg,用少量1mol/L NaOH溶解后加蒸儲水

6、 定容至100ml,即配制成0.1mg/ml的NAA母液，轉入細口試劑瓶中，貼上標簽，注明母液 名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩? - BA母液配制方法相似，濃度為2mg/ml五、試驗結果分析及注意事項1、KH2PO4是吸熱溶解，可以把燒杯浸在溫水中溶解。2、制作標簽時只能能用鉛筆寫。實驗二、培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實驗目的1、學習母液法配制培養(yǎng)基。2、學習用牛皮紙包三角瓶口的防污染方法。3、學習滅菌鍋的使用。二、實驗原理為防止組織培養(yǎng)各物質發(fā)生反應所以把微量和鐵鹽混在一起，為了避免物質的反應，所以要迅速倒入沸騰的蒸儲水中，瓊脂應慢慢倒入，并邊攪拌邊倒入。組織培養(yǎng)所用的培

7、養(yǎng)基含有植物生長所必需的各類營養(yǎng)物質，同時也是微生物繁殖的極好場所，因此必須對培養(yǎng)基滅菌處理，以確保無菌操作的順利進行。三、實驗材料、試劑和儀器設備.試劑：瓊脂，蔗糖，蒸儲水，1mol/L NaOH,各類母液2.儀器設備：電子天平，燒杯，量 筒，移液管，玻璃棒，藥芍，稱量紙，PH試紙，錐形瓶，牛皮紙，棉塞等。四、實驗步驟.準備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定谿。.大量的量取 取50ml量筒一個，將大量、有機、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依 次稱取并倒入500ml燒杯中。.微量鐵鹽的量取 取50ml量筒一個，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。

8、.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個，加入 1.5L蒸儲水，谿于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒 入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。再稱量瓊脂16克，白砂糖60克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至2L。5、調PH用1mol/L NaOH和1mol/LHCl調PH至6.0。6、分裝把培養(yǎng)基分裝到三角瓶 中，每瓶約50ml ,用棉塞塞好再用牛皮紙，細繩包扎好，待滅菌。7、滅菌將所有的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調為 121度滅菌20min。滅 完后擺放在水平的實驗桌上勿動。五、試驗結果分析及注意事項1、配制培養(yǎng)基前先大致估計一下藥品數(shù)量，不夠時提前配制。2、三角瓶滅菌時

9、注意要放干凈冷空氣。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。4、滅完菌的三角瓶勿動，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。實驗三、胡蘿卜外植體的表面消毒及接種一、實驗目的與意義培養(yǎng)材料的滅菌與接種是組織培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)節(jié)。通過本實驗，領會無菌培養(yǎng)對實驗材料消毒，接種的要求，初步掌握培養(yǎng)材料滅菌，接種的操作技術。二、實驗步驟(1)準備好培養(yǎng)基、無菌水、無菌濾紙、解剖刀、鐐子、打火機等及接種工具。(2)將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具谿于接種臺上，打開超凈臺紫外燈開關，同時打開接種室內的紫外燈，用紫外燈照射至少25min ,然后關室內的紫外燈，開送風開關，關閉臺內的紫外燈，通風10min后，再開日光燈進行無菌操作

10、。(3)接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。(4)將外植體進行表面滅菌。(6)用75%酒精擦洗接種臺表面。(7)接種用的鐐子使用前插入 75%的乙醇溶液中，使用鐐子時在酒精燈上灼燒，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。(8)在酒精燈火焰旁揭去封口膜，將瓶口傾斜接近水平方向，用火焰灼燒瓶口，灼燒時應 不斷轉動瓶口，左手持瓶，使其靠近火焰，右手將燒過的鐐子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻， 夾取切好的胡蘿卜小塊，將其放在培養(yǎng)基上，用鐐子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。(9)轉動瓶口灼燒，蓋上封口膜，標上接種日期、材料名稱、姓名等。(10)將接種材料移到培養(yǎng)室

11、培養(yǎng)。三、注意事項(1)工作臺接種時，應盡量避免做明顯擾亂氣流的動作。操作過程中要不時用75%的酒精擦拭雙手。(2)接種前的污染現(xiàn)象：若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴或放谿培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌群密度過大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。培養(yǎng)瓶不潔凈、滅菌不徹底也是導致接種前培養(yǎng)基污染的 原因。（3）接種后的污染：菌落分布不勻 ，此種情況主要是接種過程中發(fā)生的污染所致?？赡苁墙?種室不潔凈、菌類池子過多、鐐子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺。出現(xiàn)故障等原因引起。避免方法：保持無菌接種室潔凈；在接種前用紫外燈滅菌時間不低于20-30 min ;用75%酒精噴霧殺菌降塵，超凈臺開啟 15-20 min后方可使用；鐐子等接種工具嚴格徹底滅菌；操作 過程中經常用 75%酒精等消毒劑擦洗手部等措施接種后外植體周圍發(fā)生菌類污染可能因外 植體表面滅菌不徹底所致。如果培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說明消毒劑浸泡的時間短；若接種材料雖然沒有污染， 但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時間過長，組織被破壞死亡；接種材料若沒有出現(xiàn)污染，生 長正常，即可以認為消毒時間適宜。四、胡蘿卜愈傷組織誘導結果總接種材接種時間形成愈傷污染的材愈傷組織污染率備注料數(shù)（大）組織的材料數(shù)