1、關于可降解塑料的生物合成第一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 可降解塑料概述 石化工業(yè)的興起，使得石油化工合成塑料在人類生活中扮演著重要的角色，70年代以來，塑料工業(yè)得到迅猛的發(fā)展，無論工業(yè)、農業(yè)、建筑業(yè)、還是人們的日常生活，無不與塑料密切相關。 但目前所使用的化學合成塑料在自然環(huán)境中很難分解，也不會被腐蝕，燃燒處理又會產生有害氣體，越來越多的塑料垃圾卻對環(huán)境造成巨大的危害。 第二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 普通塑料是以合成樹脂為主的化學合成材料。對環(huán)境污染具有以下特點： 污染范圍廣，江河湖泊、田野山川無處不有。 污染物增長量快。 據統(tǒng)計，全世界每年對塑料的需求

2、量為1億噸，傾入海洋的塑料垃圾達數10萬噸，陸上的更是難以計數。 1985年我國農用薄膜為30萬噸，1990年為50萬噸，2005年，中國包裝用塑料需求量達到了500萬噸，按30%為難以收集的一次性塑料包裝材料和制品計算，則廢棄物產生量達150萬噸。我國可覆蓋地膜的面積為5億多畝，需求量已達到100萬。第三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 處理難。塑料具有耐酸堿、抗氧化、難腐蝕、難降解的特性。埋地里處理百年不爛；燃燒時產生大量有毒氣體，如HCl、SOx、CO等。 各種塑料及相近制品在環(huán)境中被預期降解的時間制 品 自動售 鋁罐 聚乙烯泡 可處置 木制筷子 塑料瓶 貨機杯 沫杯/盤 尿布

3、 （PET）時間/a 20 100 500 20 20 100 回收利用難。塑料制品種類多，填料、顏料多樣，難以分揀回收再利用。 生態(tài)環(huán)境危害大。地膜降低耕地質量，農作物植株矮小，抗病力差；殘膜隨風飄動，對周圍環(huán)境、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)都有很大的影響第四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 數量如此巨大的塑料垃圾對生態(tài)和環(huán)境產生了嚴重的影響，由此引發(fā)的環(huán)境問題將日益嚴重。許多國家已開始用生物可降解塑料代替部分石油化工合成塑料，并陸續(xù)頒布了一些法規(guī)，禁用某些塑料制品。 如意大利已立法規(guī)定自1991年起所有包裝用塑料都必須生物可降解，我國也開始禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。 當前，生產降解

4、塑料的國家主要有美國、意大利、德國、加拿大、日本、中國等。第五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 美國是開發(fā)降解塑料的主要國家之一，主要有十幾家單位，如塑料降解研究聯合體（PDRC）、生物/環(huán)境降解塑料研究會（BEOPS）等，其宗旨在于進行有關降解材料合成、加工工藝、降解試驗、測試技術和方法標準體系的建立。 近年日本相繼成立了生物降解塑料研究會、生物降解塑料實用化檢討委員會，日本通產省已將生物降解塑料作為繼金屬材料、無機材料、高分子材料之后的“第四類新材料”。 歐洲Bhre-Eurae更是對生物降解塑料建立了完善的降解評價體系。第六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 生物降解塑

5、料是指在自然環(huán)境下通過微生物的生命活動能很快降解的高分子材料。按其降解特性可分為完全生物降解塑料和生物破壞性塑料。按其來源則可分為天然高分子材料、微生物合成材料、化學合成材料、摻混型材料等。 天然高分子型是利用淀粉、纖維素、甲殼質、蛋白質等天然高分子材料制備的生物降解材料。這類物質來源豐富，可完全生物降解，而且產物安全無毒性，日益受到重視。 美國Warner-Lambert公司開發(fā)了由70%支鏈淀粉和30%直鏈淀粉制成的新型樹脂，有良好的生物降解性，可替代農業(yè)上使用的各種生物降解材料。第七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在眾多的生物可降解材料中，采用微生物發(fā)酵法生產的聚-羥基烷酸（

6、簡稱PHAs），成為應用環(huán)境生物學方面的一個研究的熱點。其中，-羥基丁酸（簡稱PHB）及3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物簡稱P(3HB-co-3HV)或PHBV是PHAs族中研究和應用最廣泛的兩種多聚體。 聚-羥基烷酸（PHAs）作為一種有光學活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如質輕、彈性、可塑性、耐磨性、抗射性等外，更重要的是它還具有生物可降解性和生物可相容性。第八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然環(huán)境中9個月后，可基本上被完全降解，而同樣用合成塑料制作的物品，完全降解時間約需100年。因此，研究和開發(fā)聚-羥基烷酸（PHAs）

7、，使之成為同類用途的石化合成塑料最有潛在的替代品，可避免或減少塑料廢物對環(huán)境的污染，具有深遠的環(huán)境意義。第九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) PHAs的結構、物理化學性質和應用 O CH CH2 C nORR為甲基時，單體為-羥基?。℉B）；R為乙基時，單體為-羥基戊酸（HV）；R為丙基時，單體為-羥基己酸（HC）；R為丁基時，單體為-羥基庚酸（HH）； n為單體的數目。 R為甲基時，其聚合物為-羥基丁酸（PHB） ， R為乙基時，其聚合物為-羥基戊酸（PHV）；其他依次類推。PHAs的通式可寫成：第十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 多種微生物在一定條件下能在細胞內

8、積累聚-羥基烷酸（PHAs）作為碳源和能源的貯存物。 我們采用溶劑法從不同細菌中可以提取這些多聚物，有些多聚物的相對分子質量可高達2106。 每個PHA顆粒含有數千條多聚體鏈。這些多聚物的物理化學性質和機械性能如韌度、脆性、熔點、玻璃態(tài)溫度和抗溶劑性等與單體的組成有極大的關系。 例如3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的（PHBV）共聚物中-羥基戊酸組分的增加可使熔點從180oC（PHB）降至75oC。第十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 多數有關細菌聚-羥基烷酸（PHAs）的物理化學性質的研究是針對-羥基丁酸（PHB）及3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物（PHBV）兩種聚合物進行的。 PH

9、B是高度結晶的晶體，其物理性質以及分子結構上與聚丙烯（PP）很相似，例如熔點、玻璃態(tài)溫度、結晶度、抗張強度等，而PHB具有相對密度大、透氧率低和抗紫外線照射以及具有光學活性、阻濕性和壓電性等優(yōu)點。 聚-羥基烷酸（PHAs）的生物降解性和生物相容性是許多化學合成塑料所不具備的。PHAs這類熱塑性聚酯能紡絲、壓膜或注塑，在工業(yè)上可用作各類包裝材料等，在醫(yī)藥方面的應用由于有生物相容性的特點，可作外科縫線、骨骼代用品或骨板，手術后無需取出。 第十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 研究還發(fā)現PHB的降解產物D(-)-3-羥基丁酸是所有高等動物中的一種普遍存在的中間產物，在原核生物和真核生物中

10、發(fā)現的含有100-200個單體的小分子量PHB，具有作為細胞膜離子通道組成的作用，并且在人體的血漿中也檢測到它的大量存在。所以，植入哺乳動物組織的-羥基丁酸（PHB）不會對機體產生毒性。 表8-2-2 PHAs的應用 應用范圍 PHAs的應用 外科縫線、肘釘、拭子等；傷口敷 料；血管替代品；骨骼替代品和骨 醫(yī)藥上 板（由于壓電效應能促進骨骼生長）； 長效藥物的生物降解載體 長效除莠劑、抗真菌劑、殺蟲劑； 肥料等的生物降解載體；容器、瓶、 工業(yè)上 袋、薄膜等包裝材料；婦女衛(wèi)生用品、 尿布等；合成手性化合物的前體原料第十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) PHAs的生物合成一、合成

11、PHAs的主要微生物二、合成PHAs的主要基質三、 PHAs的代謝途徑與調控第十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、合成PHAs的主要微生物 能產生聚-羥基烷酸（PHAs）微生物分布極廣，包括光能和化能自養(yǎng)及異養(yǎng)菌，計65個屬中的近300種微生物。 目前研究較多的用于合成PHAs的微生物有：產堿桿菌屬，假單胞菌屬，甲基營養(yǎng)菌，固氮菌屬和紅螺菌屬等。它們能分別利用不同的碳源產生不同的PHAs。 在多數情況下微生物能利用糖加丙酸或戊酸產生PHBV的，并可通過改變兩者的配比控制共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸價格高，且對細菌有毒，因而在培養(yǎng)液中的濃度必須控制很低，產率及轉化率都不高

12、，這些也是生產上的不利因素。第十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 上個世紀90年代以來發(fā)現，在分類上屬于紅球菌屬、諾卡氏菌屬和棒桿菌屬中的一些菌能利用葡萄糖或其他單一碳源產生含HB和HV的PHA。 上個世紀末，有人觀察到真養(yǎng)產堿桿菌H16的異亮氨酸缺陷型突變株R8能從單一的無關連碳源例如果糖或葡萄糖酸等產生PHBV。以果糖為碳源時，共聚物占細胞干重的47%。 這些發(fā)現不僅給PHA生物合成和調節(jié)機制的研究增加了新的內容，而且對探索從廉價的單一碳源生產PHBV方面開辟了一條新的途徑。 第十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 選擇工業(yè)生產PHAs的菌種可以考慮以下幾個因素，主要

13、包括細菌能利用廉價碳源的能力、生長速率、多聚物合成速率和能在細胞內最大積累多聚物的程度。 如英國ICI公司分別對固氮菌、甲基營養(yǎng)菌和真氧產堿桿菌進行了考察： 首先，放棄了固氮菌、因為這類菌還會產生多糖，從而降低了-羥基丁酸（PHB）的產率。 其次，否定了甲基營養(yǎng)菌，這類菌的PHB產率不高，胞內PHB含量僅為65%左右。 第三，舍去了甲醇，雖然甲醇的價格低，但轉化系數也低， 經考察，最終選擇了真養(yǎng)產堿桿菌作為PHAs的生產菌株，因為該菌株生長快、易培養(yǎng)、胞內PHB含量高、聚合物的分子量大以及能利用各種較經濟的碳源。第十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、合成PHAs的主要基質 1.糖

14、質碳源 可用來工業(yè)化生產PHA的糖質碳源有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。 （1）葡萄糖 真養(yǎng)產堿桿菌野生株H16利用果糖積累PHB，其利用葡萄糖的變異株已用于工業(yè)生產PHB。 如凱姆等人采用細胞密度培養(yǎng)的方法，通過在線葡萄糖濃度的控制，首先使菌體平衡生長至70g/L，再讓其積累PHB，50h細胞濃度達164g/L，干細胞中PHB含76%，發(fā)酵液中含量為121g/L，PHB的生產強度為2.42g/（ Lh ），是目前世界上已報道的最高記錄。 第十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）蔗糖及糖蜜 肥大產堿桿菌能利用蔗糖積累-羥基丁酸（PHB），采用分批補料培養(yǎng)的方法積累的PHB量達60

15、g/L以上，目前已中試生產的水平為15m3反應器每周生產1tPHB。該菌的特點是生長較快，能利用廉價的甜菜或甘蔗糖蜜，并且細胞生長與PHB的積累同步。 但是，使用糖蜜作基質還很有爭議。培格認為，用甜菜糖蜜作基質其價格是葡萄糖的1/2，而ICI公司認為糖本身雖然價格較低，但雜質多，增加了PHB積累的難度，為了提高PHB含量，糖蜜原料需精制，這就增加了成本。另外，使用糖蜜還會給后提取增加困難（如粘度大，需脫色等），糖蜜系季節(jié)性產品，儲運不易，再有糖蜜含糖量較低（通常含糖50%以下），如用來作細胞的高密度培養(yǎng)還需補加純糖，這也會影響成本，所以從使用糖蜜的總效益綜合考慮，盡管糖蜜本身廉價，用于實際生產

16、上仍有許多困難需要克服。第十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.甲醇 甲醇是最便宜的基質之一，但由于甲醇菌積累PHB含量不高，加大了PHB回收過程的成本，而且PHB的分子量較小，故ICI公司放棄了這條路線。 但由于甲醇價格低，仍然吸引人們尋求新的菌種和開發(fā)更有效的培養(yǎng)方法。 凱姆等使用嗜有機甲基桿菌，在微機輔助的自動補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)中，在限鉀的條件下（25mg/L）大量生產PHB，甲醇濃度維持在2-3g/L時不抑制細胞的生長，培養(yǎng)70h細胞濃度高達250g/L，是當今高密度培養(yǎng)產PHB細胞濃度的最高記錄。 第二十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 3氣體H2/CO2/O2

17、 真養(yǎng)產堿桿菌等一些爆鳴氣細菌能利用H2/CO2/O2產生-羥基丁酸（PHB），其中H2作為能源，CO2是碳源。 H2是一種干凈的可再生資源。通過同化CO2生產生物降解塑料，可以同時解決溫室效應及廢棄的非降解塑料的危害等兩個嚴重的環(huán)境污染問題。但在技術上要解決混合氣體爆鳴的安全問題和氣體的循環(huán)利用問題。 控制基質氣相中氧的濃度低于氣體爆炸的下限（6.9%）是安全的，而循環(huán)氣體的閉路培養(yǎng)體系能有效地利用氣體。 田中等人研究了真養(yǎng)產堿桿菌利用H2/CO2/O2 的高密度培養(yǎng)產PHB的最新結果是，在限氧條件下培養(yǎng)40h，細胞濃度和PHB濃度分別達到91.3g/L和61.9g/L。第二十一張，PPT共

18、五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 4烷烴及其衍生物 假單胞菌能利用中等鏈長的烷烴或其衍生物醇、酸等產生中等鏈長羥基烷酸的共聚物（PHAMCL），而共聚物中單體的組成與基質碳架的長度有關。 以辛烷作基質連續(xù)培養(yǎng)食油假單胞菌，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和增加氧的轉移率，穩(wěn)定態(tài)細胞濃度增至11.6g/L，用傳氧很有效的反應器作分批補料培養(yǎng)，38h細胞濃度為37.1 g/L， PHA占細胞干重的33%。 如通純氧以適應細胞對氧的需要、用辛酸分批補料培養(yǎng)45h，細胞濃度為41.8 g/L， PHA占細胞干重的37.1%。第二十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月三、PHAs 的代謝途徑與調控 研究表明，許多微

19、生物在碳源過量而其他某種營養(yǎng)成分，如氮、磷、鎂或氧不足時，能在細胞內大量積累聚-羥基烷酸，以作為碳源和能源的貯存物。 當限制性營養(yǎng)物再次被提供時，PHAs 能被細胞內酶降解后作為碳源和能源利用。 細胞中積累的PHAs以單個粒子的形態(tài)存在，不同微生物細胞含有的顆粒數量及顆粒大小不同。 在真養(yǎng)產堿桿菌中，每個細胞含有810個顆粒，每個顆粒直徑大小為0.20.5m。 在電子顯微鏡中觀察到這些內含物具有高度的折光性，顆粒外面包裹著一層膜，該膜沒有生物膜那樣的典型雙層結構，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系統(tǒng)。 第二十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 PHAs除在微生物饑餓條件下作為碳源和能源

20、外，還為微生物在其他環(huán)境壓力條件下（如滲透壓、脫水或紫外線照射）的生存起著重要的作用。 一般說來，在惡劣環(huán)境下含有PHAs的細胞微生物比不含PHAs的細胞具有更高的存活率。 最近研究發(fā)現，PHAs除了作為細胞內貯物的生理作用外，還是細胞膜的結構化合物。 不同微生物合成PHAs的途徑不同，基質不同，其合成途徑也有差異，這是微生物代謝多樣性的一種表現。第二十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在不同微生物中，利用不同基質合成PHA的主要途徑包括： （1）真養(yǎng)產堿桿菌及多數細菌利用糖作為基質合成PHB; （2）深紅紅螺菌利用糖作為基質合成PHB; （3）食油假單胞菌等利用中鏈烴、醇及酸合成

21、具有與基質鏈長有關的HA單位的PHA； （4）一株產堿桿菌利用長鏈偶碳數脂肪酸合成PHB; （5）銅綠假單胞菌等利用糖質碳源合成具有中鏈HA單位的PHA; （6）真養(yǎng)產堿桿菌等利用糖加丙酸合成PHBV。 第二十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月在真養(yǎng)產堿桿菌以及許多微生物中，PHB 是從已酰CoA通過三步反應合成。 一是由生物合成的-酮基硫酯酶催化兩個已酰CoA的cc結合； 二是由依賴NADPH的已酰已酰CoA還原酶催化產生D(-)3-羥基丁酰CoA ； 三是由PHB聚合酶將D(-)3-羥基丁酰CoA連接到PHB 正在增長的鏈上。第二十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四

22、節(jié) PHAs的發(fā)酵生產一、 PHAs的流加發(fā)酵二、 PHB發(fā)酵過程中理論產率的計算第二十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 PHAs的流加發(fā)酵 阻礙聚-羥基烷酸（PHAs）實現大規(guī)模工業(yè)化生產的主要障礙是生產成本問題。影響PHAs生產成本的主要因素有菌種、原料、操作方式以及提取方法等。 所以，降低PHAs的生產成本主要考慮以下幾點： 其一，采用廉價基質（如CO2、H2和O2或甲醇、乙醇、葡萄糖及來自農業(yè)廢物的有機酸等）和提高最終產物對基質的產率系數，以降低發(fā)酵原材料的成本。 其二，提高生產強度（如選育高產菌株，采用合適的發(fā)酵生產方式等），以降低操作成本。 其三，改進提取、純化技術

23、（如不采用價格昂貴的有機溶劑、簡化操作等），以降低提取成本。第二十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 除上述3點外，還應采用適宜的發(fā)酵生產方式，這是提高聚合物的生產率和改進其質量的關鍵。 現代發(fā)酵工業(yè)中，絕大多數的培養(yǎng)均采用純種液體培養(yǎng)方法，液體培養(yǎng)的操作方法主要有間歇（分批）培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)3種。 細胞的分批培養(yǎng)是一種間歇培養(yǎng)方式。在培養(yǎng)時，培養(yǎng)系統(tǒng)除了需不斷進行通氣和加入酸堿溶液以及排出廢氣外，與外界沒有其他的物料交換。在分批培養(yǎng)中，細胞濃度、基質濃度和產物濃度均不斷發(fā)生變化。第二十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 連續(xù)培養(yǎng)的方法是將新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地加入有均

24、勻培養(yǎng)液的反應器中，同時排出發(fā)酵液，使培養(yǎng)環(huán)境如底物濃度、產物濃度、細胞濃度、比生長速率等可不隨時間變化而變化，保持培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)。在連續(xù)培養(yǎng)中，任何一種營養(yǎng)成分都可以用作限制性底物。 所謂流加培養(yǎng)，又稱半連續(xù)發(fā)酵，是指在培養(yǎng)過程中不斷向反應器內加入培養(yǎng)基，但不同時取出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。它是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方法。兼有兩者的優(yōu)點，而又克服了兩者的缺點。和傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)相比，流加培養(yǎng)可以解除底物抑制、葡萄糖效應、代謝阻遏等；與連續(xù)培養(yǎng)相比，流加培養(yǎng)的染菌可能性小，也不易產生菌種老化變異等。第三十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 所謂限制性底物，是指在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物

25、質中，對微生物的生長起到限制作用的營養(yǎng)物。 由于許多微生物只有在氮、磷或氧等缺乏而碳源過量的不平衡生長條件下才能大量積累PHAs，所以在PHAs的發(fā)酵生產中，一般可將發(fā)酵過程分成兩個階段來進行控制： 第一階段為菌體細胞的形成階段，在此階段微生物利用基質形成大量菌體，而多聚體PHAs的積累量很少； 第二階段為多聚體形成階段，在此階段PHAs大量形成而菌體細胞基本上不繁殖。第三十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在簡單分批培養(yǎng)過程中，當菌體生長進行到一定濃度時，培養(yǎng)基中一種或幾種營養(yǎng)物質的濃度可能成為菌體細胞進一步繁殖的限制因素，而簡單地增加該種營養(yǎng)物質的初始濃度不可能導致菌體生長量的

26、相應增加，相反某些成分在較高濃度時對細胞會產生毒害作用，另一些還可能形成沉淀，因而采用分批發(fā)酵法不能獲得很高的細胞干重以及高的產物濃度和生產強度。 而采用流加發(fā)酵法進行PHAs的生產時，就可以在某些必需的營養(yǎng)成分成為生長限制因素之前，對其進行定量流加，延長細胞的對數生長期，從而可獲得較高的菌體濃度。 第三十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一） 采用流加培養(yǎng)法生產PHB 在實際應用中，通常選擇限制培養(yǎng)基中的氮源作為流加控制的手段，因為微生物的生長對氮源的依賴比對其他離子更強，微生物對氮源的同化作用也比其他離子更快。 研究發(fā)現，在流加培養(yǎng)過程中，控制恰當的碳氮比相當重要。為什么？

27、在PHB 合成階段開始時，采用較低的碳氮比可以保持細胞具有較高的PHB合成能力，隨著胞內PHB 含量的增加，微生物細胞的PHB合成能力下降，這時可逐漸增加培養(yǎng)基中的碳氮比。 第三十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在流加培養(yǎng)過程中，可以通過在線檢測尾氣中CO2濃度，來間接估計胞內PHB含量，達到適時控制培養(yǎng)過程中碳氮比的目的。 真氧產堿桿菌A.eutrophus是到目前為止對其動力學和代謝途徑研究得較為透徹的、也是唯一已用于工業(yè)過程來生產多聚體的一類微生物，此菌能利用多種基質如葡萄糖、果糖、乙酸、丁酸或H2、O2和CO2的混合氣體等來合成PHB。第三十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于

28、2022年6月 通過對真氧產堿桿菌其生長過程的動力學研究發(fā)現，在菌體生長階段和PHB形成階段之間存在一短暫的過度階段，此過程階段在氮源耗盡的同時形成，僅維持不到一個世代時間，此時，殘留菌體和蛋白質的形成速率降為零，并且它們的含量在隨后的時間內保持恒定，而PHB的形成速率迅速達到最大值，隨后逐漸下降至最終為零。 很明顯，在以氮源為限制條件的PHB形成過程中，限量添加氮源能促進PHB的積累，這些結果與前面提到的用甲基營養(yǎng)菌合成PHB的情況相一致，在PHB形成階段維持很低濃度的氮源時， PHB的形成速率比不加氮源的情況要高。第三十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（二） 采用流加培養(yǎng)法生產

29、共聚物P（HB-co-HV） 由3-羥基丁酸和3-羥基戊酸聚合而成的共聚物P（HB-co-HV） 是瓦爾恩等人在1974年從活性污泥的絮凝物中分離出的第一個共聚物，也是目前最具工業(yè)前景和吸引力的共聚物。 在共聚物P（HB-co-HV）的生產過程中，流加發(fā)酵操作比分批發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢。為什么？ 丙酸或戊酸是生產共聚物P（HB-co-HV） 所必需的基質，由于這些有機酸對菌體細胞具有一定的毒性，采用流加培養(yǎng)法，可避免由于培養(yǎng)基中有機酸的積累而使細胞活力受到損害，從而達到提高P（HB-co-HV） 產率的目的。 第三十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 除3-羥基丁酸外，現在已知有40多種

30、不同的脂肪酸可作為PHAs的組成成分。 最近的研究發(fā)現，大多數能積累PHB的微生物也具有積累共聚物P（HB-co-HV）的能力，而且各種微生物從有機酸合成共聚物P（HB-co-HV）的途徑和對有機酸的耐受能力也各不相同。 由于所用的合成共聚物的基質（如丙酸或戊酸）價格相對較昂貴，如果丙酸在代謝過程中轉向產能或形成乙酰CoA，進而形成HB單體，將會使共聚物中HV單體的含量下降而導致生產成本的增加。第三十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 除丙酸和戊酸能被作為生產共聚物P（HB-co-HV）的基質外，最近得到的由真氧產堿桿菌A.eutrophus 異亮氨酸缺陷型突變株自發(fā)轉變成的光養(yǎng)株R

31、3，能從單一的如葡萄糖或果糖等無關聯碳源產生共聚物P（HB-co-HV）。 例如以果糖為碳源時，共聚物占細胞干重的47%， HV單體含量7%，這些發(fā)現，一方面給PHAs生物合成和調節(jié)機制的研究增加了新的內容，同時，也開辟了一條探索從廉價的單一碳源生產共聚物P（HB-co-HV）的新路。 第三十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）流加培養(yǎng)條件對多聚體相對分子質量分布的影響 多聚體的相對分子質量常常影響其質量和生物降解的速率。 一般平均相對分子質量大且相對分子質量分布范圍窄的多聚體具有更廣泛的工業(yè)應用前景，并且提取也較方便，而對于某些特殊用途，相對分子質量不宜超過1105。 多聚體的

32、平均相對分子質量大小受流加培養(yǎng)條件的影響。當培養(yǎng)條件恒定時，其平均相對分子質量也可以保持恒定，因而只要控制適宜的流加培養(yǎng)條件，就可將其相對分子質量控制在所需的范圍之內。第三十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 蘇祖凱等人對假單胞菌屬的微生物以甲醇為基質合成PHB時的培養(yǎng)條件（如溫度、pH、甲醇濃度等）進行了研究。 發(fā)現溫度會影響PHB的形成速率和含量，但對其聚合度沒有影響； pH值對聚合物平均相對分子質量的影響很??； 在流加培養(yǎng)過程中，甲醇濃度對多聚體平均相對分子質量的大小有顯著影響。 當甲醇濃度很低（如0.5g/L）時，其平均相對分子質量可達8105，當甲醇濃度很高（如32g/L）

33、時，其平均相對分子質量小于0.5 105 。第四十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 除采用改變流加培養(yǎng)中基質濃度的方法來改變聚合物的相對分子質量大小外，另一個方法是利用細胞內PHB 的不平衡降解來改變其相對分子質量分布。 細胞積累多聚體是為其在惡劣環(huán)境下生存所用，因而，如果在培養(yǎng)過程中的某一階段僅添加氮源而不加碳源，PHB就會被細胞降解，作為能源加以利用，而且，低分子量聚合物的降解速率大于高分子量聚合物的降解速率。 這可使PHB的平均相對分子質量轉換至較高的值。 為了獲得更均質的共聚體，在共聚物P（HB-co-HV）的積累階段開始時，應先使培養(yǎng)物處于碳源饑餓狀態(tài)，這樣可使細胞內源PH

34、B的量大大降低，得到的共聚物P（HB-co-HV）就較為均一。第四十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、 PHB發(fā)酵過程中理論產率的計算 PHB是僅有C、H和O元素組成的多聚物，在合成PHB所需的基質中，碳源的消耗量最大，所占發(fā)酵原料成本的比例也最大，因而，產物PHB對碳源的產率Yp/c，是影響PHB工業(yè)化規(guī)模生產的重要因素。 PHB發(fā)酵過程的理論產率和總產率： 從簡單的數學角度考慮很容易推斷，在假定沒有非PHB部分的殘留菌體合成時，產物PHB對碳源的產率Yp/c，可達到最大值，該最大值被命名為PHB對碳源的理論產率Yp/c； 當考慮到在平衡生長階段形成菌體所消耗的碳源時，該實際產

35、率Y1p/c，稱為總產率。第四十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 通常有兩種不同的方法來計算理論產率，即化學計算法和生化計算法。 在生化計算法中，必須仔細考慮合成PHB過程的代謝途徑和輔酶的再循環(huán)過程。 在大多數細菌中， PHB是從乙酰CoA經3個連續(xù)的反應而形成的，這三個反應分別被3-酮基硫解酶、依賴于NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶和PHB合成酶所催化。 必須注意到乙酰乙酰CoA還原酶是與NADPH相關連的，即該酶僅催化下列反應： 乙酰-CoA + NADPH + H+ D-3-羥基丁酰CoA + NADP+ （1式）第四十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 盡管在P

36、HB合成途徑的3個反應中，即不需要NAD+也不需要ATP，但必須考慮包括PHB生物合成途徑在內的所有途徑中NAD+/NADH和ATP/ADP的再循環(huán)，這些輔助基質的缺乏不可能使代謝中間產物順利流動。 NADP+通過6-磷酸葡萄糖脫氫酶再生，細胞內PHB合成的凈反應如下： 葡萄糖+（3p+1）ADP+（ 3p+1 ）Pi+（3/2）O2 （1/n）PHB+2CO2+3H2O+（ 3p+1 ）ATP （2式） 式中p是P/O比率，從該反應式中可以計算出PHB對基質葡萄糖的理論產率為：YP/C =86/180 = 0.48第四十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 總的產率是從實際發(fā)酵過程中

37、計算出來的，PHB在細胞生長停止后積累或部分在細胞生長的同時積累。 假定所消耗的總碳量（-St），分成兩部分，合成PHB所耗部分為（-S1），合成非PHB的菌體所消耗的部分為（-S2），則有： （-St）= （-S1）+ （-S2） （3式）第四十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) PHAs的提取技術 PHB的提取技術主要涉及到兩個問題： 一是方法的合理性，主要表現在提取率、產物的純度，提取過程是否對PHB 的結構產生影響，從實驗室到工業(yè)生產放大的可行性，以及操作是否方便，預、后處理是否復雜，環(huán)境污染程度等。 二是過程的經濟性，表現在提取所用材料費用、能量消耗以及設備投資等。

38、由于PHB 以顆粒狀態(tài)存在于細胞中，分離提取比較困難，所以，探索PHB 的提取方法以降低提取成本具有十分重要的意義。第四十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、有機溶劑法 有機溶劑包括：氯仿、二氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。 其基本原理是，這些有機溶劑一方面能改變細胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHB溶解到溶劑中，而非PHB的細胞物質不能溶解，從而將PHB與其他物質分離開來。 第四十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 用有機溶劑的方法進行提取得到的 PHB純度可達到很高，但存在以下缺點： （1）當溶劑中含有超過50g/L的PHB時，溶液變得很粘，要

39、去掉細胞的殘余物很困難； （2）即使經過多次反復提取，仍有一定量的PHB存在于菌體中，所以提取率難以達到很高； （3）使用大量的有機溶劑，盡管溶劑可回收再用，但仍造成巨大的原料消耗； （4）大量有毒、易爆、揮發(fā)溶劑的使用，對環(huán)境造成嚴重污染，給操作帶來不便。 第四十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、次氯酸鈉法 次氯酸鈉能夠破胞，而且對細胞中的非PHB的細胞物質的消化很有效。用該方法具有破胞所得產品的純度較高、提取速度快等優(yōu)點。但由于次氯酸鈉對PHB分子有嚴重的降解作用，因此所獲得的PHB分子量小。 為了克服其缺點，哈恩等人結合氯仿提取時PHB純度高，而且被降解程度小的特點，發(fā)明了

40、用分散的次氯酸鈉/氯仿提取PHB的方法。 次氯酸鈉/氯仿的方法比單純使用氯仿提取率高，比單純使用次氯酸鈉分子量大。但此方法仍然需要使用大量有機溶劑，并且操作比較復雜，所以限制了其在工業(yè)上的應用。第四十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月三、酶 法 酶法提取PHB的原理與次氯酸鈉法類似，即讓大量的非PHB的細胞物質溶解，而PHB不溶解，從而達到分離、提純的目的。 由于非PHB的細胞物質通常包括蛋白質等大分子物質，實際上是通過多種酶的協同作用來達到消化非PHB的細胞物質。 單純使用酶來消化細胞中的雜質成分，所得PHB的純度不高，需結合其他的方法，如再用表面活性劑處理，可得到較高純度的PHB。 酶法提取PHB，其提取成本較高、處理過程較復雜，在實際應用中仍然受到很大限制。第五十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月四、表面活性劑/次氯酸鈉法 為了克服酶法提取PHB存在的操作步驟多以及酶作用條件苛刻的不足，同時為了盡量避免使用有機溶劑而用水相體系提取PHB，人們研究了用表面活性劑/次氯酸鈉法提取PHB。 用這種方法提取PHB的原理，有人認為，在低濃度時，表面活性劑單個分子進入到細胞膜的磷脂雙層中；隨著表面活性劑濃度的增加，更多表面活性劑分子結合到磷脂雙層中，表面活性劑與磷脂形成