1、課題3血紅蛋白的提取和分離課標(biāo)領(lǐng)航1概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。2能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作的過程是否規(guī)范，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗(yàn)從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本過程和方法?！局攸c(diǎn)】凝膠色譜法、電泳法基本原理?！倦y點(diǎn)】實(shí)驗(yàn)操作的過程及分析。情境導(dǎo)引為年老多病的人注射丙種球蛋白，可以在一定程度上增強(qiáng)其身體的抵抗力。在動(dòng)物體內(nèi)，丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合在一起。要獲得純凈的丙種球蛋白制品，就必須進(jìn)行提取和分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)了樣

2、品中各種分子的分離?；A(chǔ)自主梳理一、凝膠色譜法1概念：也稱作分配色譜法，是根據(jù)_質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理(1)由微小的多孔球體構(gòu)成的凝膠，內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子(2)由相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快，從而使相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。二、緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的_對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。較小凝膠外部酸和堿2配制：由12種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以得到不

3、同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。三、電泳1概念：指_在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。2原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷_的電極移動(dòng)。使用比例帶電粒子相反3作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身的大小、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。4方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。四、實(shí)驗(yàn)操作1樣品處理：通過_、_、分離血紅蛋白溶液等操作收集血紅蛋白溶液。(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。分離時(shí)采取低速短時(shí)間離心，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已

4、洗滌干凈。形狀遷移速度紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放思考感悟1洗滌紅細(xì)胞時(shí)為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水？【提示】生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細(xì)胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。(2)血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和_的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。甲苯思考感悟2在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？【提示】(1)加入蒸餾水使紅細(xì)胞吸水漲破。(2)細(xì)胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機(jī)溶劑，加入甲苯能加速紅細(xì)胞破裂并釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：把攪拌好的混合液離心后,將試管中的液體用

5、濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體。2粗分離：即透析(1)方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋放入一定量適宜濃度的_中，透析12 h.(2)目的：將樣品中分子較小的雜質(zhì)除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。磷酸緩沖液3純化：通過凝膠色譜柱將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。操作如下：(1)凝膠色譜柱的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填材料：本實(shí)驗(yàn)使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。方法：凝膠用_充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有_存在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(3)樣品的加入和洗脫a.準(zhǔn)備：加樣前，

6、打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與_平齊，關(guān)閉出口。蒸餾水氣泡凝膠面b加樣：用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。c加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi).洗脫：加入_，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。4純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。五、操作提示1紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)、_與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白：離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使_等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。磷酸緩沖液離心速度白細(xì)胞2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用_加熱，加速膨脹。3凝膠色譜柱的裝填：

7、在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。4蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶_地移動(dòng)，說明色譜柱制作成功。沸水浴均勻一致核心要點(diǎn)突破要點(diǎn)一解讀實(shí)驗(yàn)原理1蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆叫∮谀z顆?？障吨睆竭\(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路程較短較長(zhǎng)洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出來后從凝柱中洗脫出來2.電泳方法瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場(chǎng)中遷移速率決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀不同在凝膠中加入SDS，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形

8、成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，使其遷移速率完全取決于分子的大小 (2011年聊城高二檢測(cè))有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是()A它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B它們的原理相同C使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D以上說法都正確【嘗試解答】_A_例1【解析】凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待測(cè)樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度?！菊`區(qū)警示】不同的蛋白質(zhì)在凝膠色譜中有三種運(yùn)動(dòng)情況：(1)分子很小，可進(jìn)入凝膠全部?jī)?nèi)孔隙；(2)分子很大

9、，完全不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；(3)分子大小適中，能進(jìn)入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)部分。跟蹤訓(xùn)練下列各項(xiàng)中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的分離度的是()A層析柱的高度B層析柱的直徑C緩沖溶液 D樣品的分布解析：選B。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。樣品的分布也影響分離度，緩沖溶液的pH影響蛋白質(zhì)所帶的電荷，因此也影響分離度。只有層析柱的直徑一般不會(huì)影響分離度。要點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離一般分四步：樣品處理粗分離純化純度鑒定。1樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌采集血樣低速短時(shí)間離心吸取血漿鹽水洗滌低速離心重復(fù)步驟三次。特別提醒(1

10、)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。(2)離心時(shí)轉(zhuǎn)速要低，時(shí)間要短，一般為500 r/min，離心2 min。(3)洗滌三次后，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)。特別提醒(1)將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層。(2)將濾液于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的血紅蛋白水溶液層。(4)透析取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。目的是除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。(2)凝膠色譜柱的裝填(本實(shí)驗(yàn)使用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠)固定：將色譜柱垂直固定在支架上裝填：將凝膠懸

11、浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi)洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h(3)樣品的加入和洗脫調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用量為1 mL樣品滲入凝膠床：樣品完全滲進(jìn)凝膠層洗脫：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集特別提醒(1)滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。(2)在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動(dòng)情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功。 下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品的加入(圖)和洗脫(圖)示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題。例2(1)在加樣示意圖

12、中，正確的加樣順序是_。(2)用吸管加樣時(shí)，應(yīng)注意正確操作，分別是_、貼著管壁加樣、_。(3)等樣品_時(shí)，才加入緩沖液，待_接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每_mL收集一管，連續(xù)收集?！緡L試解答】(1)(2)不要破壞凝膠面使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)(3)完全進(jìn)入凝膠層紅色的蛋白質(zhì)5【解析】加樣品時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行操作，吸管應(yīng)貼著管壁，管口沿著管壁環(huán)繞移動(dòng)，還應(yīng)注意不要破壞凝膠面。等樣品完全進(jìn)入到凝膠層時(shí)，才加入緩沖液進(jìn)行洗脫?！咎揭?guī)尋律】對(duì)分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功?！净?dòng)探究】(1)凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？(2)血紅蛋白溶液是如何分離的？【提示】(1)裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)約時(shí)間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。裝填時(shí)不能有氣泡，氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(2)蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)離心原理進(jìn)行的。當(dāng)含有細(xì)小顆粒