1、摘要：通過對綠豆種子的研磨破碎獲得SOD粗酶，經(jīng)過硫酸銨分級分離、透析除鹽和濃縮等過程，除去粗酶液中的雜質(zhì)及干擾蛋白，采用葡聚糖（SephadexG-100）凝膠層析得到純化的SOD酶。跟蹤提純過程活性的分布，并評價提取過程各步驟的效率。實驗結(jié)果證實隨著不斷的分離提純，總活力以及總蛋白不斷減小，比活力不斷上升，最終得到的結(jié)果為總純化倍數(shù)為0.68，活性得率為5.24%。一、前言：超氧化物歧化酶簡稱SOD，是一種新型酶制劑，屬金屬酶。分布很廣，幾乎從哺乳動物到細菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧陰離子（O2-）歧化反應的酶類，能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧自由基（

2、O.）,生成HO和O.HO由過222222氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2,從而減少自由基對有機體的毒害。它的存在與生物體內(nèi)的解毒作用有關(guān)，也發(fā)現(xiàn)與機體的衰老、腫瘤及免疫性疾病等有關(guān)。自1968年發(fā)現(xiàn)SOD后，立刻引起科學界的高度重視，近40年來這方面的研究進展非常迅速，它的應用領(lǐng)域日益拓寬，SOD也有了產(chǎn)品.國外從牛紅細胞中制得的超氧化物歧化酶,其商品名為Orgotein.不少人研究Orgotein的藥理性質(zhì)，證明它無毒，無抗原性，能抗發(fā)炎、抗超氧離子、抗病毒感染。二十世紀80年代后期，我國關(guān)于SOD的研究及應用也形成了熱點，如今已在化妝品添加劑、飲料及醫(yī)藥方面顯示了特殊效果。SOD作

3、為治因而受到醫(yī)藥界的關(guān)注。目前中國國內(nèi)已進入臨床試驗階段。本實驗以綠豆為原料提取SOD，通過各步的分離提純，應測得酶總活力逐漸減小，比活逐漸升高.通過本實驗掌握物質(zhì)分離純化的實驗設計過程，以及硫酸銨分離、透析除鹽、濃縮和葡聚糖凝膠層析等物質(zhì)分離技術(shù)。二、實驗材料與方法：一材料:綠豆種子,市售新鮮綠豆種子浸泡蒸餾水24小時備用.二試劑:葡聚糖（sephadexG-100）,NaCl（AP）,磷酸氫二鈉（AP）,磷酸二氫鈉（AP）,三羥甲基氨基甲烷（Tris）,鹽酸（濃鹽酸），硫酸銨（AP）,PEG6000，考馬斯亮藍G250,磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA,連苯三酚（焦性沒食子酸），ED

4、TA（鈉鹽），超氧化物歧化酶（sigma公司）。三儀器:離心機，紫外分光光度計，柱層析裝置，玻璃層析柱，勻漿機，各型號燒杯、試管、量筒，帶毛塞試管，漏斗，移液槍，移液管，玻璃棒，電子天平等。四實驗方法和步驟：稱25g綠豆，洗滌，蒸餾水浸泡過夜，加入250mlpH70.05mol/Lpb液，勻漿機勻漿，兩層紗布過濾，離心（3000rpm）得清液，取少量清液作為樣1進行SOD活性測量，計算材料中SOD總活性單位及比活性單位（units/mgPr）。所得清液測量總體積，緩慢加入硫酸銨至35%飽和度，濃度為19.4g/100ml,4C冰箱靜置分層。離心（3000rpm）取清液，取少量為樣，測量SOD活

5、性、蛋白質(zhì)含量測量，計算SOD總活性單位及活性單位。步驟3中的清液緩慢加入硫酸銨至65%飽和度（過程充分攪拌），5C至分層，離心（3000rpm）取沉淀，取樣，計算SOD總活性單位及活性單位。準備透析袋：透析袋事先預處理，Na2CO310g/L,EDTA1mmol/L煮沸30分鐘，蒸餾水洗滌，并浸泡于5C中備用。所得清液測量其部體積，緩慢加入硫酸銨至65%飽和度（18.4g/100ml）（過程充分攪拌），5C靜置至分層澄清，離心除去清液，得沉淀。沉淀溶于水并定容到一定體積，裝入透析袋，于蒸溜水中透析過夜。透析后溶液用濾紙過濾得清液。重新裝入透析袋中用PEG6000包埋進行濃縮。裝柱：先向柱內(nèi)加

6、滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要排除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15%。調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。但稀釋度太高則一次裝柱的高度不夠。將一根直徑稍小的玻璃棒插入層析柱底部，沿玻璃棒將膠漿徐徐注人柱內(nèi)，一邊灌膠，一邊提起玻棒。注意避免產(chǎn)生氣泡。柱要一次裝完。柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。柱內(nèi)膠面上部保留23cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來（層析柱平衡過程,1ml/min,1.5h）。調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，

7、得到理想流速（1ml/min）加樣：上述濃縮液過濾后得清液加樣，要盡量快速、均勻。一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1%5%（質(zhì)量分數(shù)）左右.（這里用5%）。加樣應加于柱中心，避免沿柱壁加入。洗脫：恒壓重力洗脫。這里采用1ml/min,一般每一收集部份不大于2ml,本實驗因為儀器的數(shù)量問題，每份收集4ml,收集液總體積為柱床總體積的1.2倍即完成收集。體積20ml層析過程：樣品：濃縮液T離心T過濾T葡聚糖凝膠層析分離純化SOD實驗結(jié)果表4.葡聚糖G100凝膠層析洗脫曲線（以A280吸收作為蛋白質(zhì)含量的相對值）試管號(1)(2(3(4)(5)吸光值（nm）0.5710.7830.9390.

8、6560.481試管號(6)(7)(8)(9)吸光值（nm）0.3010.2270.1550.077試管號(10)(11)(12)(13)吸光值（nm）0.0850.0520.0370.046圖2.葡聚糖SephadexG100凝膠層析分蛋白質(zhì)洗脫曲線經(jīng)連苯三酚粗測，3號管顏色最淺，而根據(jù)蛋白質(zhì)洗脫曲線看出3號管位于蛋白質(zhì)含量峰上，所以選取3號管作為目的試管收集SOD，測量其準確SOD活力和蛋白含量，計算SOD比活力。連苯三酚自氧化速率:連苯三酚=10ul;A=0.064表6.連苯三酚測樣品5S0D活性（A325）試管號連苯三酚/ul樣品ul/AA(1)10100.035(2)10100.03

9、7(3)10100.041(4)10100.033(5)10100.037(6)10100.029(7)10100.032(8)10100.035(9)10100.040(10)10100.028(11)10100.041(12)10100.034(13)10100.036計算得：比活力Kd.064-0.041）/0.064x2=0.72提取液的總活力0.72x（5一0.01）=360總蛋白量（5一0.01）x0.04738=23.69SOD的比活力360十23.69=15.20得率的計算：得率二本次總活力/上次總活力X100%SOD總得率二最后樣品活力/樣1活力X100%360/6868X1

10、00%=5.24%純化倍數(shù)的計算:純化倍數(shù)=比活2/比活11.0621.01=1.050.9121.06=0.861.0620.91=1.160.7221.06=0.68步驟總活力（U）總蛋白（mg）比活力（U/mgpro）純化倍數(shù)樣16868670.7510.24樣26943586.2911.841.05樣31820159.4411.410.86樣435327.7512.731.16試管336023.6915.200.68+系列1圖3.各純化步驟中SOD總酶活變化趨勢+系列1圖4.各純化步驟中SOD總蛋白含量變化趨勢總結(jié)：試驗首次接觸到SOD的分離純化技術(shù)，讓我熟悉并且理解到了酶純化的過程。

11、雖然實驗中有幾次操作出現(xiàn)了問題導致記錄了錯誤的數(shù)據(jù)，而且因為當時操作的時候?qū)嶒灢⒉皇煜?，所以并不知道所測結(jié)果誤差比較大，導致在最后處理數(shù)據(jù)的時候才發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)誤差不在可接受范圍內(nèi)。而且實驗過程中的儀器也不是很準確，經(jīng)常發(fā)生失誤。所以實驗數(shù)據(jù)不是很理想。盡管如此，但本次實驗的目的在于熟悉掌握酶的分離純化技術(shù)，了解一般酶分離純化的步驟。經(jīng)過這次實驗，也深刻體會到酶分離純化的步驟，希望能在接下來的實驗里面得以應用。本次實驗歷史三周，材料中酶蛋白的活性在最后實驗中已經(jīng)是一種幾乎沒有活力的狀態(tài)，從曲線圖可以看出前兩周的酶活力以及蛋白還保持在一個比較好的狀態(tài)，而第三周開始呈現(xiàn)出極大的衰弱的趨勢，導致實驗后期的數(shù)據(jù)沒有明顯的意義，希望以后實驗可以安排在一周或者兩周里面完成，可以讓數(shù)據(jù)更加有分析性，整個實驗也更有意