1、備課人】：【上課時(shí)間】：【課時(shí)數(shù)】：1課時(shí)【課題】：課題6血紅蛋白的提取和分離【備課時(shí)間】：【課型】：復(fù)習(xí)【復(fù)習(xí)目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)?！緩?fù)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)】復(fù)習(xí)重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。復(fù)習(xí)難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。【知識(shí)回顧】：一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通

2、過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程：混合物上柱i洗脫i大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢i收集大分子i收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。（4）作用：分離蛋白質(zhì)，測(cè)定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4/Na2HPO4等）調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。3凝膠電泳法：（1

3、）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、實(shí)驗(yàn)步驟1樣品處理紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三

4、次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。2粗分離分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2II層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層,第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中,將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)

5、的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。3純化調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝I膠面平齊，關(guān)閉出口。加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后，丨打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，I關(guān)閉出口。調(diào)節(jié)緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度I洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度4.純度鑒定S

6、DS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項(xiàng)1.電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2.紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶

7、均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。4為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。5沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。6G-75G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。7裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什

8、么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。9與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。10如何檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。【典例解析】用凝膠色譜法分

9、離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（）A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢D路程較短，移動(dòng)速度較快【習(xí)題鞏固】一選擇題1凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。A相同B相反C相對(duì)D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ.NaCIB甲苯C.蒸餾水D檸檬酸鈉7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）A無色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物二非選擇題1.電泳利用了待分離樣品中各種分子以及、的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？課題6例題DBBBACDC1答案：帶電性質(zhì)的差異；分子本身的大小；形狀的不同2答案：