1、過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷资铣?shù)的意義，測(cè)定過氧化氫酶的米氏常數(shù)。學(xué)習(xí)一種測(cè)定酶Km值的方法熟悉和掌握過氧化氫酶活性的測(cè)定原理和方法2二、相關(guān)知識(shí)與原理米氏方程與米氏常數(shù)（Km值） 米氏方程Km值: 酶促反應(yīng)速度為Vmax/2時(shí)的 底物濃度。單位是mol/LVmaxS Km + S 相關(guān)知識(shí)3Km值的含義Km值是酶的特征性常數(shù)之一Km值可近似表示酶對(duì)底物的親和力同一酶對(duì)于不同底物有不同的Km值測(cè)定Km是研究酶的一種重要方法，大多數(shù)酶的Km值在0.01100mmol/L之間。 4雙倒數(shù)作圖法 VmaxS Km+SV = 兩邊同取倒數(shù) （林貝氏方程） + 1/V=Km

2、Vmax 1/Vmax 1/S 繪制1/S 與1/V的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其與X軸的交點(diǎn)即為1/Km ，以此求得該酶在測(cè)定條件下的Km值。Km值的測(cè)定方法5實(shí)驗(yàn)原理過氧化氫酶催化2H2O2 2H2O+O2 反應(yīng)一定時(shí)間后，剩余過氧化氫進(jìn)行下述反應(yīng)2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O用KMnO4滴定可求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差即反應(yīng)的速度。6用不同的H2O2的起始量代表同一體系不同時(shí)刻的底物濃度。根據(jù)不同的底物濃度和對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從坐標(biāo)圖上讀出-1/Km，計(jì)算Km值。71、0.02mol/L 磷酸鹽緩沖液（ pH7.0 ）。2、0.02mol/

3、LKMnO4：稱取 KMnO4 3.2 g，加蒸餾水 1000 mL，煮沸15 min，2d后過濾，棕色瓶保存3、0.004mol/L KMnO4：稱取恒重草酸鈉0.2 g，加 250mL冷沸水及10mL濃硫酸，用0.02mol/L KMnO4 滴定至至微紅色，加熱至65 ，繼續(xù)滴定微紅色30s不褪，算出KMnO4的準(zhǔn)確濃度稀釋成0.004mol/L即可。三、試劑84、0.05mol/L H2O2:30% H2O2 23ml 加入1000ml 容量瓶中，加蒸餾水至刻度，用 0.004mol/L KMnO4 標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度 (標(biāo)定前稀釋4倍，取2mL，加25% H2SO4 2mL，用0.004m

4、ol/L KMnO4 滴定至微紅色)。(標(biāo)定0.05 mol/L H2O2的實(shí)際濃度為0.053mol/L)5、25% H2SO4 5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2+2MnSO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO491、酶液的制備： 每組(共分6組)稱取馬鈴薯5g，加磷酸緩沖液 10mL，研缽勻漿，濾紙過濾。四、實(shí)驗(yàn)步驟102、反應(yīng)速度的測(cè)定：取干燥的50-100ml錐形瓶6只，編號(hào)后按下表操作：試劑（mL）012345H2O2溶液/mL01.001.251.672.505.00蒸餾水/mL9.58.508.257.837.004.50酶液/mL0.500.500.500.500.500.50 先加好0.053mol/L H2O2和蒸餾水，加入酶液后立即混合搖勻并計(jì)錄時(shí)間，各瓶準(zhǔn)確靜置5分鐘后，立即加入25% H2SO4 2.0mL，邊加邊搖，以終止酶促反應(yīng)。最后用標(biāo)準(zhǔn)0.004 mol/L KMnO4滴定剩余的H2O2至微紅色，記錄各瓶耗KMnO4的mL數(shù)。 113、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集（根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程填寫下表）12注意事項(xiàng)反應(yīng)瓶中H2O2濃度計(jì)算： SH2O2摩爾濃度加入H2O2的mL數(shù) 10 加入H2O2的摩爾數(shù) 10 （mmol/mL）13反應(yīng)速度的計(jì)算 V = 加入的H2O2的毫摩爾數(shù)剩余的H2O2的毫摩爾數(shù)/5min = H2O2的摩