1、一、課題的立項(xiàng)依據(jù)、國(guó)（省）內(nèi)外研究現(xiàn)狀豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品之一。其營(yíng)養(yǎng)豐富，食藥兼用，對(duì)我國(guó)人民的飲食文 化和醫(yī)藥保健，發(fā)揮了重大的作用。豆豉古名“幽菽”，后更名為豆豉。東漢許慎說(shuō) 文解字說(shuō)：“豉，配鹽幽菽也”。宋丹鉛錄解釋說(shuō)：“蓋菽本豆也，以鹽配之。 幽閉盎中所成，故日幽菽”。東漢劉熙釋名、釋飲食：“豉，嗜也，五味調(diào)和須之 而成，乃可甘嗜，故齊人謂豉，聲同嗜也”。說(shuō)明豆豉是古代的重要調(diào)味品及其命名的 由來(lái)。生產(chǎn)豆豉的主要原料是大豆，原產(chǎn)于我國(guó)，栽培歷史悠久。1973年，在浙江余姚河 姆渡古文化遺址中發(fā)掘的黑豆，距今有7000年的歷史。北京自然博物館展出的山西侯馬 出土黃豆，是東周末年

2、的文物。我國(guó)古代大豆栽培十分普及，是與稻、梁、麥、黍等齊 名的主要農(nóng)作物之一。在長(zhǎng)期的栽培、食用過(guò)程中，必然會(huì)對(duì)大豆的貯存、加工等進(jìn)行 探索，偶然把吃剩的煮豆幽閉于盎中，由此有了豆豉的產(chǎn)生。唐朝時(shí)代隨著佛教的傳 播，豆豉生產(chǎn)技術(shù)先后流傳到日本、朝鮮、菲律賓、印度尼西亞等國(guó)家和地區(qū)，發(fā)展成 為具有地方特色的產(chǎn)品。如日本的納豆，印尼的丹貝均有盛名。日本、印尼率先對(duì)豆豉 進(jìn)行科學(xué)研究，分別從納豆和丹貝中發(fā)現(xiàn)有溶栓激酶，引起了世界廣泛的關(guān)注、掀起納 豆熱。然而我國(guó)的豆豉似已被人遺忘，不僅科學(xué)研究落后于日本、印尼，一些專(zhuān)業(yè)書(shū) 籍，如發(fā)行量較大的發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)、釀造工藝學(xué)等，均未將豆豉列入。 為此選題

3、研究臭豆豉纖溶酶高產(chǎn)菌株，意在喚起國(guó)人重視，希望能弘揚(yáng)我國(guó)古代科學(xué)文 化成就，發(fā)掘民族寶貴遺產(chǎn)，與時(shí)俱進(jìn)，自主創(chuàng)新，改革傳統(tǒng)工藝中落后的生產(chǎn)方式， 對(duì)其工藝中合理的因素，賦予現(xiàn)代化的內(nèi)涵，促進(jìn)我國(guó)發(fā)酵調(diào)味品科技和豆豉科研生產(chǎn) 的發(fā)展。豆豉的種類(lèi)很多，按參與制曲主要微生物的不同，可分為米曲霉型、毛霉型、根霉 型、細(xì)菌型四類(lèi)。利用米曲霉釀造豆豉，是我國(guó)最早最常用的方法。食經(jīng)、齊民 要術(shù)及歷代古籍記載的作豉法大都是米曲霉型豆豉，現(xiàn)在的北京豆豉、湖南豆豉、日 本靜岡縣濱松納豆都是米曲霉型豆豉；毛霉型豆豉以四川潼川豆豉為代表；根霉型豆豉 如印度尼西亞的丹貝；細(xì)菌型豆豉如山東水豉、貴州豆豉、日本的拉絲納豆

4、。細(xì)菌型豆 豉主要微生物是產(chǎn)生芽孢的枯草桿菌，生長(zhǎng)適溫3O37C，在5O56C尚能生長(zhǎng)。制曲 時(shí)創(chuàng)造高溫、高濕的條件，枯草桿菌能迅速生長(zhǎng)。大豆浸漬后水煮，全豆粒充分變軟，以手指輕壓即爛為度，出鍋瀝去余水、趁熱入曲室中堆積、加蓋麻袋保溫，2d后品溫漸 次升高，3d后可達(dá)50C以上，豆粒布滿(mǎn)粘液，可掌拉成絲，并有特殊氣味。彭勇和張義正利用纖維蛋白平板篩選，纖溶活性測(cè)定，SDS分析和體外溶栓實(shí) 驗(yàn)等相結(jié)合的方法，成功地從豆豉中篩選到一株纖溶活性高達(dá)520U/mL和具有良好體外 溶栓效果的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )。SDS PAGE和纖維蛋白自 顯影表明該

5、酶的分子量為28kD，其最適反應(yīng)溫度和pH值分別為42C和8.0，在pH6-10 較穩(wěn)定。PMSF和鹽酸苯甲醚能抑制纖溶活性，而EDTA和EGTA不能抑制，表明該酶是一 種絲氨酸蛋白酶。它溶解纖維蛋白的方式是直接溶解纖維蛋白，而不激活纖溶酶原，并 且不水解血細(xì)胞。袁貴英等對(duì)從河南不同地區(qū)采集了 5種農(nóng)戶(hù)自然發(fā)酵的臭豆豉樣品， 利用平板稀釋分離實(shí)驗(yàn)，對(duì)自然發(fā)酵制成的臭豆豉的微生物組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表 明：河南臭豆豉自然發(fā)酵的主要微生物為細(xì)菌類(lèi)，采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行分類(lèi)鑒定，初步確 定為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。田亞紅和劉輝從我國(guó)傳統(tǒng)食品細(xì)菌型豆豉中篩選出1 株具有高纖溶活性的納豆芽孢桿菌菌株NK

6、-1。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了該菌株 液體發(fā)酵最佳條件：大豆蛋白胨1.0%，葡萄糖2.0%，培養(yǎng)溫度35C，初始pH值為 7.0，培養(yǎng)時(shí)間72h時(shí)，該菌產(chǎn)酶纖溶活力可達(dá)1225.5尿激酶IU/mL。李華等為了明確細(xì) 菌型豆豉發(fā)酵菌株的分類(lèi)地位，采用形態(tài)及生理生化方法進(jìn)行鑒定，并根據(jù)16SrDNA測(cè) 序結(jié)果確定菌株BBDC3屬于枯草芽孢桿菌?？疾炝司N、后酵溫度和加鹽量對(duì)豆豉感官 品質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量的影響，經(jīng)統(tǒng)計(jì)比較確定，細(xì)菌型豆豉純種發(fā)酵的較優(yōu)工藝條件 是：以枯草芽孢桿菌菌株BBDC3和BBDC4的混合菌為菌種，后酵溫度50C，加鹽量 10 %。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵得到的豆豉含蛋白質(zhì)38

7、.93 %、脂肪23.90 %、灰分 14.59 %、總酸0.42 %，氨基酸態(tài)氮和三氯醋酸可溶性蛋白的含量分別為0.61 %和1.59%，大大高于原料黑豆(0.19%，0.26%)，符合我國(guó)豆豉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。臭豆豉屬于細(xì)菌型豆豉，本課題擬采用酪蛋白平板對(duì)纖溶酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行分離，并 回接到大豆上觀(guān)察其能否生產(chǎn)臭豆豉，篩選蛋白酶活性最高的菌株。通過(guò)16SrDNA測(cè)序 結(jié)果確定菌株的分類(lèi)地位。再對(duì)利用該菌株生產(chǎn)臭豆豉的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，達(dá)到發(fā)掘 民族寶貴遺產(chǎn)，與時(shí)俱進(jìn)，自主創(chuàng)新，改革傳統(tǒng)工藝中落后的生產(chǎn)方式，促進(jìn)我國(guó)發(fā)酵 臭豆豉生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)步的目的，為農(nóng)產(chǎn)品的深加工做出貢獻(xiàn)。二、課題研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)及

8、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題研究?jī)?nèi)容：臭豆豉中纖溶酶高產(chǎn)菌株的分離、純化。采用酪蛋白平板對(duì)臭豆豉樣品中的產(chǎn)纖溶酶菌株進(jìn)行分離、純化；分離的菌株回接到大豆上觀(guān)察其能否生產(chǎn)臭豆豉。篩選纖溶酶活性最高的菌株。采用體外溶血塊技術(shù)對(duì)產(chǎn)纖溶酶菌株進(jìn)行初步篩選；采用血纖維平板法對(duì)產(chǎn)纖溶酶菌株進(jìn)行復(fù)篩。通過(guò)16S rDNA測(cè)序結(jié)果確定菌株的分類(lèi)地位。細(xì)菌DNA的提?。煌ㄟ^(guò)PCR法擴(kuò)增16S rDNA片段并送到生物公司測(cè)序；16S rDNA片段測(cè)序結(jié)果的分析。研究目標(biāo)采用酪蛋白平板對(duì)臭豆豉的纖溶酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行分離、純化，篩選纖溶酶活性最高 的菌株，再通過(guò)16SrDNA測(cè)序結(jié)果確定菌株的分類(lèi)地位。三、擬采取的研究方案(技術(shù)路線(xiàn))及可行性分析(1)技術(shù)路線(xiàn)纖溶酶高產(chǎn)菌株的分離、純化優(yōu)勢(shì)菌株回接到大豆采用體外溶血塊技術(shù)初篩產(chǎn)纖溶酶菌株血纖維平板法復(fù)篩高產(chǎn)纖溶酶菌株菌株的分類(lèi)鑒定五、年度研究計(jì)劃與預(yù)期研