1、纖維素酶活性測(cè)定技術(shù)報(bào)告 NERL/TP-510-42628 2008 年 1 月實(shí)驗(yàn)室程序分析 發(fā)行日期：1996年8月12日B.阿德尼和J.貝克科羅拉多州科爾大道戈?duì)柕菄?guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室1617,80401-3393303-275-3000 美國(guó)能源部辦公室的能 源效率和可再生能源由中西部研究所巴特爾主持。合同號(hào)：DE - AC36 - 99 - GO10337免責(zé)聲明這些標(biāo)準(zhǔn)的生物分析方法是由美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室提供，這些方法由美國(guó)中西部研究所為能源部(“核磁共振”)操作。獲得和使用這些方法不得對(duì)用戶的以下義務(wù)負(fù)責(zé):該用戶被授予的權(quán)利，沒(méi)有任何費(fèi)用或成本，除提供，商業(yè)銷售，無(wú)論任何

2、目的，不得使用，復(fù)制，修改，改變，提高和分發(fā)這些方法，這整個(gè)通知包括在所有方法的副本。此外，用戶同意信貸國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室(MRI)在任何出版物涉及這些方法的使用。通過(guò)國(guó)家再生能源實(shí) 驗(yàn)室(MRI)檢查，但不得用于任何廣告或宣傳或推廣，除非有具體的產(chǎn)品或商業(yè)機(jī)構(gòu)的書(shū)面許可，必須是從國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室(MRI)通過(guò)檢查的。用戶還了解到，國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室(MRI)是沒(méi)有義務(wù)提供任何支援，咨詢，培訓(xùn)或任何形式的援助給客戶，對(duì)于這些方法的使用或提供任何更新，修訂或新版本也沒(méi)義務(wù)給客戶。這些方法是由國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室磁共振成像“原樣”及任何明 示或暗示保證，包括但不限于暗示的保證適銷性和特定用途的適用

3、性 擔(dān)保。任何情況下，國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室（MRI）檢查均不對(duì)任何 特殊、間接或間接損害或任何賠償責(zé)任，包括但不僅限于數(shù)據(jù)或利潤(rùn) 的損失請(qǐng)求權(quán)，這結(jié)果可能在合同中出現(xiàn)疏忽或其他侵權(quán)索賠行動(dòng)而 引致的或與訪問(wèn)所導(dǎo)致的使用或執(zhí)行相關(guān)的這些方法。纖維素酶活性測(cè)定技術(shù)報(bào)告1。簡(jiǎn)介1.1下面的方法介紹了纖維素酶的活性測(cè)定過(guò)程采用國(guó)際純粹化學(xué)與 應(yīng)用化學(xué)的指導(dǎo)方針。該過(guò)程已被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)量在“過(guò)濾條件下纖維 素酶的活性單位”（FPU）的原始酶液。對(duì)于酶制劑的定量結(jié)果進(jìn)行 比較，必須在此基礎(chǔ)上進(jìn)行重要的和平等的轉(zhuǎn)換。2.0毫克血糖的價(jià) 值相當(dāng)于從50毫克的過(guò)濾紙?jiān)?0分鐘（4%的轉(zhuǎn)換）已被指定為計(jì) 算所的IUP

4、AC的濾紙纖維素酶單位（FPU）的攔截的還原糖。1.2這是極為重要的一點(diǎn)，要記住：FPU的定義只是在這個(gè)意義上的 轉(zhuǎn)換。還原糖產(chǎn)量不是在檢測(cè)的混合物中線性函數(shù)酶的數(shù)量，而是由 高斯討論（1987年），兩倍的酶不會(huì)在相等的時(shí)間被預(yù)期得到兩倍還 原糖的產(chǎn)率。因此該檢測(cè)程序需要找到一種稀釋原始的酶原料，比如 一個(gè)0.5毫升稀釋液在60分鐘內(nèi)稀釋催化4%（或者，在實(shí)踐中， 發(fā)現(xiàn)兩個(gè)稀釋支架上的4%轉(zhuǎn)換點(diǎn)，使之密切合作，所需的稀釋可以得到合理的精度，有插值），然后計(jì)算符合稀釋要求原活動(dòng)（浮點(diǎn)運(yùn) 算單元/毫升）。進(jìn)一步評(píng)價(jià)所需的計(jì)算，其重要意義，要在附錄中找 到。1.3測(cè)定混合物時(shí)，可能在某些情況下含有還

5、原糖與底物蔗糖水解酶。將發(fā)酵液的檢測(cè)纖維素酶可能含有營(yíng)養(yǎng)糖，纖維素和還原端基體聚合 物的有時(shí)在任何酶的攻擊下是可以衡量葡萄糖的量。出于這個(gè)原因， 控制包括酶無(wú)需底物和酶的底物，不包括所有酶檢測(cè)值與樣品空白值 的任何修正。2。范圍2.1本程序只用于浮點(diǎn)運(yùn)算單元，在一個(gè)適當(dāng)?shù)幕钚灾校瑴y(cè)定纖維素 酶的制備過(guò)程的IUPAC定義如上所述。3。參考文獻(xiàn)3.1高斯，T.K. 1987?！皽y(cè)量纖維素酶的活動(dòng)?！奔儍舸x?；瘜W(xué)。59： 257-268。3.2米勒，G.L.1959 “利用二硝基水楊酸試劑測(cè)定還 原糖。”分析化學(xué)。31:426-428。4。意義和使用4.1這個(gè)步驟根據(jù)IUPAC （國(guó)際理論和應(yīng)用化

6、學(xué)聯(lián)合會(huì)）理論，決定 了在纖維素酶的準(zhǔn)備工作中酶活動(dòng)的濾紙功效。5。裝置設(shè)備5.1保持在50OC范圍內(nèi)的水浴。5.2能測(cè)量540nm吸光度的分光光度計(jì)。6。試劑和反應(yīng)物6.1蒸餾水1416ml二硝基水楊酸10.6g氫氧化鈉19.8g混合溶解上述物質(zhì)，然后添加羅謝爾鹽306g苯酚7.6ml （在500C時(shí)溶解）焦亞硫酸鈉8.3g將3ml樣品混合著0.1N鹽酸滴到酚猷的末端，它將需要5-6ml鹽酸，如果需要，添加氫氧化鈉。6.2檸檬酸鹽緩沖溶液：對(duì)于里氏木霉纖維素酶，在PH值為4.8的0.05M檸檬酸鹽緩沖溶液中執(zhí)行纖維素酶鑒定。對(duì)于其他纖維素酶，PH值和溫度可能會(huì)不同。當(dāng)報(bào)告結(jié)果時(shí)，鑒定的條件一

7、定是明確的。檸檬酰胺210g去離子水750ml添加氫氧化鈉直至PH為4.3BL檬在溶液中加水沖淡至1L，然后測(cè)其PH。如果需要，在溶液中加入 氫氧化鈉至PH值為4.5 .當(dāng)1M檸檬酸鹽緩沖溶液用水沖淡至50mM，那么它的PH應(yīng)該為4.8.在沖淡檸檬酸鈉緩沖溶液至PH為4.8時(shí)， 檢測(cè)和適應(yīng)它。7。思考與嘗試 7.1追隨合適的特定的衛(wèi)生計(jì)劃方針的NREL實(shí)驗(yàn)室。7.2當(dāng)使用有毒的，腐蝕的苯酚時(shí)，一定要小心。8。使纖維素糖化的濾紙分析的步驟 8.1通過(guò)類似的和完全相同的三類試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)的糖昔鍵分裂為下面講述的細(xì)節(jié)作了準(zhǔn)備。這種酶作用物是一種高級(jí)濾紙條(1.0cm*60cm)。8.2酶的試管化驗(yàn)8.

8、2.1在每個(gè)13*100的試管中放置一張卷的濾紙。8.2.2將1.0ml，PH為4.8的0.05M的檸檬酸鈉加入試管中，緩沖溶液應(yīng)該使濾紙飽和。8.2.3使令緩沖溶液的試管和酶作用物相互平衡，都達(dá)到50OC。8.2.4在檸檬酸鹽緩沖溶液中加入0.5ml稀釋的酶，至少兩種稀釋溶 液必須由酶樣品制成，一種稀釋溶液釋放超過(guò)2m的葡萄糖，另外一 種少于2mg。這兩種稀釋溶液把釋放2.1和1.9mg葡萄糖作為目標(biāo)， 依賴于酶，這種目標(biāo)實(shí)現(xiàn)比較困難，額外的稀釋溶液必須使用。8.2.5在50OC環(huán)境下培養(yǎng)60min。8.2.6在培養(yǎng)最后階段，將試管從50OC水浴中移出，通過(guò)和加入 3mlDNS試劑并與溶液混

9、合使酶停止反應(yīng)。8.3試劑和反應(yīng)物dr檬8.3.1試劑溶液：1.5ml檸檬酸鹽緩沖溶液。8.3.2酶控制：1.0ml檸檬酸鹽緩沖溶液+0.5ml稀釋的酶（為每個(gè)稀釋溶液準(zhǔn)備一個(gè)獨(dú)立的控制）。8.3.3酶作用物控制:1.5ml檸檬酸鹽緩沖溶液+濾紙條。8.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)8.4.1無(wú)水葡萄糖的庫(kù)存解決方案應(yīng)該制定部分這些存貨應(yīng)該密封 和冷藏在融解并確保充分混合后，這種標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是旋渦。8.4.2稀釋溶液在以下方式中的庫(kù)存制成的。1.0ml+0.5ml buffer=1:1.5=6.7mg/ml(3.35mg/0.5ml)1.0ml+1.0ml bufFer=1:2=5mg/ml(2.5mg/0.5ml

10、)1.0ml+2.0ml buffer=1:3=6.7mg/ml(1.65mg/0.5ml)1.0ml+4.0ml buffer=1:1.5=2mg/ml(1.0mg/0.5ml)8.4.3含有1.0ml檸檬酸鈉緩沖溶液的應(yīng)該通過(guò)在13*100mm的試管 中加入0.5ml葡萄糖緩沖溶液來(lái)準(zhǔn)備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試管。8.4.4應(yīng)該在50OC時(shí)和酶化驗(yàn)試管一起培養(yǎng)，然后在60OC時(shí)通過(guò) 加入3.0mlDNS試劑停止培養(yǎng)。8.5 發(fā)展(Miller,1959)8.5.1在含有足夠水的持續(xù)沸騰的水浴中加熱所有試管5min來(lái)覆蓋 部分被混合著試劑的反應(yīng)物占有的試管，所有的樣品應(yīng)該一起煮沸。 在煮沸后，移至冰水浴

11、。8.5.2讓試管靜置直至產(chǎn)生沉淀，用離心機(jī)器簡(jiǎn)單分離，在水中沖淡 所有試管。通過(guò)測(cè)量吸光度決定顏色的形成。這種在上面描述的稀 釋的吸光度應(yīng)該在0.1到1.0A。9。結(jié)果9.1利用過(guò)量的葡萄糖(mg/0.5ml)搭配A構(gòu)建葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的線540性曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)應(yīng)密切符合適當(dāng)?shù)闹本€，直線的關(guān)聯(lián)系數(shù) 是最接近的那一個(gè)。驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)運(yùn)行一個(gè)校準(zhǔn)驗(yàn)證的直線，一種獨(dú)立的，準(zhǔn)備好的溶液，里面包含已知量的葡萄糖濃度為標(biāo)準(zhǔn) 曲線上的一半。9.2使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的葡萄糖量為每個(gè)樣品試管在減去空白的 酶之后得出來(lái)的。9.3估計(jì)將2.0mg的葡萄糖的酶濃度和一大塊葡萄糖酶濃度的對(duì)數(shù) 做比較。（請(qǐng)參考附錄B

12、，就是使用半對(duì)數(shù)方格紙）。為了找到要求的 酶的濃度，兩份數(shù)據(jù)指出需要非常 接近2.0ml，然后在它們之間畫(huà) 一條路線，使用此線兩點(diǎn)之間找到稀釋的酶，將產(chǎn)生和2.0mg葡萄 糖等價(jià)的還原糖，附錄B提供了一個(gè)例子：在這個(gè)部分，在下面計(jì)算FPU的等式中，酶濃度在這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指 在酶稀釋溶液中原來(lái)酶所占的比例。9.4計(jì)算FPUFPU=0.37/（酶）20mg葡萄糖在公式中，酶代表了在直接測(cè)試酶稀釋溶液里面的原來(lái)的酶的比 重，由此引出的FPU見(jiàn)GHOSE（1987）和附錄A。9.5用IUPAC-FPU計(jì)算一個(gè)例子涉及附錄B。10。精度和偏差10.1精度的測(cè)量只有精確的重復(fù)測(cè)量相同的數(shù)量的酶。這個(gè)過(guò)程， 如

13、果仔細(xì)地進(jìn)行，應(yīng)該像得到其他實(shí)驗(yàn)室使用相同的過(guò)程那樣得到同 樣的近似數(shù)字讀數(shù)。用濾紙檢測(cè)的精度可能受固有的纖維素酶制劑的 物理特性的影響。11。質(zhì)量控制11.1報(bào)道有象征意義的數(shù)字:典型的效果顯著的統(tǒng)計(jì)報(bào)告作為整個(gè) 整數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。報(bào)道之前必須明確檢測(cè)條件的結(jié)果。11.2重復(fù):配制每個(gè)稀釋溶液，一式三份。11.3空白:所描述的那部分“空白和控制”。11.4標(biāo)準(zhǔn):不是百分之相對(duì)不同定義，依賴于這種被測(cè)試的酶。11.5方法:不可自審核標(biāo)準(zhǔn)酶隨時(shí)間變化。11.6標(biāo)準(zhǔn)檢定校準(zhǔn):校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)獨(dú)立標(biāo)定及分析所描述的那部分“計(jì) 算”。11.7樣本大小:依賴于酶濃度。11.8樣本貯存:根據(jù)樣本酶的來(lái)源及廠商的使用

14、說(shuō)明。11.9貯存：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存在-20oC或準(zhǔn)備新鮮的批次，請(qǐng)?jiān)谑褂们坝昧Φ?搖勻。11.10標(biāo)準(zhǔn):所描述的那部分“葡萄糖水平”。11.11定義了一批:各種標(biāo)準(zhǔn)、空白及樣品在一起。由于通過(guò)工具約 束這批樣品的大小是有限的，不應(yīng)大于實(shí)際處理的標(biāo)準(zhǔn)大小。11.12控制圖:不適用。11.13其他:不適用。12。附錄A:在方程的數(shù)值用于計(jì)算，濾紙的活動(dòng)實(shí)際的底線是，如果使用按照說(shuō)明的指示，這些計(jì)算進(jìn)行了計(jì)算公式, 在獲得的結(jié)果一致公認(rèn)的活動(dòng)，在“濾紙單位”，將會(huì)得到在世界上其 它實(shí)驗(yàn)室，是這些酶解試題。對(duì)于那些工人感興趣的這個(gè)方程，推導(dǎo)出 的“濾紙單位”，結(jié)合Ghose(1987)，下面的意見(jiàn)可能是有益

15、的。分子（0.37）方程的系數(shù)為轉(zhuǎn)換。2.0毫克的葡萄糖水準(zhǔn)產(chǎn)生的分析方法，葡萄糖（2.00.18016），從量的測(cè)試，用于檢測(cè)（0.5毫升）,并由溶解時(shí)間（60分鐘）所需的減少。因?yàn)樵诜帜干稀敖退貪舛取笔且环N無(wú)量綱化方程的數(shù)量（等于比例 的酶素濃度在0.5毫升的酶稀釋加入檢測(cè)到這種酶濃度原方案）、價(jià)值預(yù)期FPU右邊的方程,因此風(fēng)和單位（mmol min-1mL-1）,看起來(lái)像“國(guó)際單位/ mL”（廖/毫升）。Ghose自己所指出的，然而，由于FPU化驗(yàn)是非線性的，使用國(guó)際單 位本身是不正確的，因?yàn)檫@個(gè)單位是基于最初的速度，即線性反應(yīng)產(chǎn)生 的產(chǎn)品以相同的速度在每分每秒的反應(yīng)?！弊髡呃^續(xù)建議FP

16、U價(jià)值觀 對(duì)于一個(gè)給定的纖維素酶解給出簡(jiǎn)單的結(jié)論稱為“單位/ mL”?！盀V紙單位”的定義。由于上述選擇的數(shù)值,“濾紙單位”實(shí)際上 不是明確的定義。濾紙單位的定義是0.1875 FPU,即酶活動(dòng)的數(shù)量赧 據(jù)指令的結(jié)果，將會(huì)產(chǎn)生包含減少相當(dāng)于2.0毫克的糖的葡萄糖。一個(gè) 能從等式驗(yàn)證了由計(jì)算假定的酶解不需要進(jìn)行稀釋來(lái)滿足。還原糖含量相當(dāng)于2.0毫克的葡萄糖（例如，“酵素濃度”的比例分 母等于1,在這種情況下，這個(gè)活動(dòng)的解進(jìn)行測(cè)量為0.37濾紙單元每毫 升。因?yàn)?.5毫升的這個(gè)方案被用于檢測(cè)、絕對(duì)數(shù)量的酶活性的測(cè)定, 從中可看出等作用能被0.1875 FPU）。另一方面，我們有一個(gè)確定的方法測(cè)量了纖

17、維素酶的活性0.1875含 有濾紙單元每0.5毫升化驗(yàn)aliquot（0.37濾紙單位曼梯里的酶解）, 但是我們沒(méi)有辦法測(cè)量酶解的濾紙活動(dòng)和其他任何價(jià)值的解決方案。含有超過(guò)0.37”單位”每毫升須因此被稀釋到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量的價(jià)值, 并含有少于0.37單位“每毫升”、還原糖產(chǎn)生于60分鐘小于2.0毫克 的等效 葡萄糖）不能指定的“濾紙單位”的活動(dòng)。這些后者 “sub-2.0-mg 要么必須集中在解決溶解之前,要么活動(dòng)的化驗(yàn)報(bào)告 不應(yīng)該報(bào)道為“濾紙單位”，而是應(yīng)報(bào)告為“mmoles葡萄糖平均每分 鐘釋放量”。Ghose（1987）解釋的特殊情況下參與計(jì)量濾紙?；顒?dòng)”，工人正在呼 吁關(guān)注文本的文章（

18、特別是文本圍繞方程的263頁(yè)），而不僅僅是“提 升”的方程式本身。13。附錄B:為例IUPAC-FPU計(jì)算13.1纖維素酶活性測(cè)定酶制劑的使用方法，概述了在IUPAC基礎(chǔ)上的方法。在所有的酶稀釋，檸檬酸鈉緩沖4.8,下表所示的酶解正在被稀 釋的酶在檸檬酸中緩沖1:20。術(shù)語(yǔ)“專注”是用來(lái)表示這個(gè)比例的 原酶解存在于稀釋加入了胰高糖素的混合物。舉個(gè)例子，一個(gè)1:101:20稀釋的股票的工作將集中酶的0005。稀釋#檸檬酸緩EL檬1:20 酶濃度*沖(ml)16501700(ml)3503000.008750.00750318002000.00500418501500.00375519001000.0025013.2葡萄糖稀釋標(biāo)準(zhǔn)和做出稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖的股票(mL)檸