1、.微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告 微生物的檢驗(yàn)與檢測(cè)：.；第 PAGE 8 頁(yè) 共 NUMPAGES 8 頁(yè)微生物的檢驗(yàn)與檢測(cè)*生命科學(xué)學(xué)院 09級(jí)生物工程班【摘要】水的微生物學(xué)檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，對(duì)保證飲用程度安和控制傳染病有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)情況的重要目的。國(guó)家飲用水規(guī)范規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超越3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每毫升不超越100個(gè)。水的微生物檢查通常包括兩個(gè)工程：細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群測(cè)定。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上構(gòu)成的菌落(colony-formingunit，CFU)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。

2、它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在3724h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)菌 大腸菌群 微生物檢驗(yàn) 微生物檢測(cè)大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是衛(wèi)生領(lǐng)域用語(yǔ)。大腸菌群包括了大腸艾希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界廣泛存在。調(diào)查研討闡明，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)?；顒?dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要緣由。糞便中多以典型大腸桿

3、菌為主，而外界環(huán)境中那么以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群是作為糞便污染目的菌提出來(lái)的，主要是以該菌群的檢出情況來(lái)表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，闡明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體安康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有安康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除普通正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致病菌存在如沙門氏菌、志賀氏菌等，因此食品中有糞便污染，那么可以推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的能夠性，埋伏著食物中毒和流行病的要挾，必需看作對(duì)人體安康具有潛在的危險(xiǎn)性。大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要目的之一，目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛運(yùn)用于食品衛(wèi)生任務(wù)中。1 資料和方法1.1 資

4、料1.1.1 培育基：牛肉膏蛋白胨固體培育基瓊脂為1.5%；乳糖蛋白胨培育液(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏3，乳糖 5，氯化鈉 5，溴甲酚紫 0.016，pH 7.3伊紅美藍(lán)培育基(g/L)：蛋白胨 10，乳糖 10，磷酸氫二鉀 2，2%伊紅水溶液 20ml，0.5 %美藍(lán)水溶液 13ml ，瓊脂 20，pH 7.21.1.2 實(shí)驗(yàn)用品：水樣采集器滅菌處置，Eppendorf離心管，Tips，微量加樣槍，無(wú)菌水，250ml三角瓶滅菌處置，滅菌培育皿1.1.3 規(guī)范菌株：規(guī)范大腸埃希氏菌與沙門氏桿菌斜面培育物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)十一鑒定為大腸菌群的斜面培育物1.1.4 抗血清：兔抗沙門氏菌、大腸埃希氏菌菌

5、體的抗血清(委托公司制備)1.2 水樣采集1.2.1 采月湖水的采集：用ETC-1A采水器采集0.5-1米水深樣品，然后置于滅菌三角瓶待分析。1.2.2 采集疑似大腸菌群較多的水源，方法同上。(南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校仙林分校北門口河水)1.3 樣品處置1.3.1 池水的稀釋：在滅菌離心管中取100L池水加900 L無(wú)菌水，混勻，制備10-1的稀釋液。原液和10-1的稀釋液用于平板計(jì)數(shù)。1.3.2 根據(jù)南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校仙林分校北門口河水水樣的污染程度將水樣稀釋成10-1、10-2稀釋度。1.3.3 抗體的制備：選擇安康的兔子作為抗血清制備動(dòng)物。注射滅活的抗原菌液濃度約為109/mL，第1次耳緣靜脈注射0.

6、2 mL，以后每隔2d注射1次，抗原注射量依次為0.4 、0.6、1、2 和2mL等。取血，分別血清，測(cè)其凝集效價(jià)。假設(shè)效價(jià)符合要求后，取兔血，待血凝后，離心分別出血清，裝入滅菌的血清瓶中并參與0. 01%硫柳汞防腐劑，-20度保管，備用。1.4 樣品的平板操作1.4.1 池水樣(每組5塊平板) 取原液和10-1稀釋度的水樣各1ml放入培育皿內(nèi)，傾注15mL融化后冷卻的牛肉膏蛋白胨培育基，立刻在桌面作平面旋搖。留意樣品與培育基混合時(shí)，可將皿底在平面上先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反方向旋轉(zhuǎn)，使其充分混勻。旋轉(zhuǎn)時(shí)小心，不要使混合物濺到皿邊上方。每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，然后置于37倒置培育。另取一無(wú)菌

7、培育皿，傾注15mL牛肉膏蛋白胨培育基作為整個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照。1.5 大腸菌群的檢測(cè)多管發(fā)酵法1.5.1 初發(fā)酵檢測(cè)乳糖蛋白胨液體培育基 1.5.2 平板分別將24h培育產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管內(nèi)的培育物分別劃線接種于伊紅美蘭瓊脂平板上，37培育18-24h，將符合以下特征的菌落的一小部分進(jìn)展涂片作革蘭氏染色并鏡檢。深紫黑色、有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色，中心顏色較深。 伊紅和美藍(lán)可抑制G+生長(zhǎng)；不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌菌落無(wú)色透明；能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸力弱，菌落為棕色；發(fā)酵乳酸，產(chǎn)酸才干強(qiáng)，菌落紫色，有綠色金屬閃光。1.5.3 革蘭氏染色察看將陽(yáng)性結(jié)果的菌落取部分涂片，進(jìn)展革蘭氏染色，察

8、看結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果的規(guī)范：革蘭氏陰性，且無(wú)芽孢。1.5.4 復(fù)發(fā)酵確認(rèn)將革蘭氏陰性無(wú)芽孢的菌落接種于乳糖蛋白胨液體培育基中，每管可接種同一初發(fā)酵管的同類型菌落12個(gè)，37度培育24小時(shí)，察看結(jié)果。 陽(yáng)性結(jié)果的規(guī)范：發(fā)酵液變?yōu)辄S色 杜氏小管內(nèi)有氣泡1.6 大腸桿菌和沙門氏菌的血清學(xué)檢驗(yàn)1.6.1 菌懸液的制備在離心管中參與100l生理鹽水。用接種環(huán)刮取平板上的菌苔于離心管中。用槍頭反復(fù)吹吸，使菌液混勻。1.6.2 大腸桿菌、沙門氏菌抗原性檢測(cè)事先將干凈載玻片做上標(biāo)志，取10倍稀釋的大腸桿菌抗血清和沙門氏菌抗血清，各40L于載玻片上。然后，分別參與大腸桿菌和沙門氏菌的菌懸液各40 L。放置于空培育皿

9、中，于37度保溫15-20min。溫育后，檢查能否有顆粒狀沉淀。實(shí)驗(yàn)表示圖：2 結(jié)果2.1 菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)以菌落構(gòu)成單位colony-forming units, CFU)計(jì)數(shù)。2.1.1 平皿菌落數(shù)的選擇：先計(jì)算一樣稀釋度的平均菌落數(shù)。假設(shè)其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，那么不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。假設(shè)片狀菌苔的面積大小缺乏平板的一半，而其他的一半平板菌落分布又比較均勻，那么可將此一半的菌落數(shù)乘以2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)。2.1.2 稀釋度的選擇2.1.3 菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用

10、二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以4舍5入方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示見表中報(bào)告方式欄 *假設(shè)空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，那么此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。附：稀釋度選擇和菌落報(bào)告數(shù)方式平板菌落分布圖菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì)表水樣不同稀釋度的平均菌落數(shù)菌落總數(shù)CFU/mL報(bào)告方式CFU/mL未稀釋10-1采月湖湖水62(63，60)7(6，8)6262結(jié)論：采月湖水符合國(guó)家水源規(guī)范2.2 查表計(jì)數(shù)根據(jù)三個(gè)梯度即三個(gè)取水樣的體積每5管中出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的管數(shù)，查閱 總大腸菌群MPNMost Probable Number檢索表，得到大腸菌群5次反復(fù)測(cè)試統(tǒng)計(jì)表的細(xì)菌最能夠數(shù)，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，

11、即可換算為100mL水樣中的大腸菌群數(shù)。附：MPN計(jì)數(shù)法最大能夠數(shù)(most probable number，MPN)計(jì)數(shù)又稱稀釋培育計(jì)數(shù)，適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功能的類群。 MPN計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品作一系列稀釋，不斷稀釋到將少量如lm1的稀釋液接種到新穎培育基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)生長(zhǎng)繁衍。根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最大能夠數(shù)實(shí)際，可以計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。 本次實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)每升水樣中大腸菌群數(shù)量取水樣的體積mL原液1mL/管10-1稀釋度1mL/管10-2稀釋度1mL/管管數(shù)5管5管5管陽(yáng)性管數(shù)5管5管5管菌數(shù)近似

12、值16000 飲用水、水源水、游泳池水衛(wèi)生的國(guó)家規(guī)范飲 用 水 1L水不得超越3個(gè) 預(yù)備加氯消毒后供飲用的水(水源水) 1000預(yù)備凈化處置及加氯消毒后供飲用的水(水源水) 10000游泳池水 100結(jié)論：南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校仙林分校北門口河水中大腸桿菌群數(shù)極多，超越國(guó)家水源規(guī)范初發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果 復(fù)發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果劃線平板分別 革蘭氏染色2.3 大腸桿菌和沙門氏菌的血清學(xué)檢驗(yàn)抗原性檢測(cè)結(jié)果3 討論3.1 MPN檢索表：MPN 為最大能夠數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)展延續(xù)系列進(jìn)展稀釋，參與培育基進(jìn)展培育，從規(guī)定的反響呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近

13、似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，那么表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或添加10倍。留意國(guó)家規(guī)范和行業(yè)規(guī)范中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報(bào)告單位也不一樣。3.2初發(fā)酵和證明實(shí)驗(yàn)：無(wú)論是國(guó)家規(guī)范的三步法還是行業(yè)規(guī)范的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)展了兩次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培育基的配制略有不同，但都是為了證明培育物能否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能一定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證明實(shí)驗(yàn)后，有時(shí)能夠成為陰性。有數(shù)聽闡明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證明實(shí)驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)踐檢測(cè)任務(wù)中，證明實(shí)驗(yàn)是必需的。3.3挑選菌落：國(guó)家規(guī)范中，需求對(duì)初發(fā)酵陽(yáng)性培育物接種伊紅美藍(lán)平板分別，對(duì)典型和可疑菌落進(jìn)展察看和證明實(shí)驗(yàn)。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形狀等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率親密相關(guān)。國(guó)家規(guī)范方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分別培育基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有親密關(guān)系，只挑取一個(gè)菌