1、脂肪酶酶解奶油制備天然香原料香精香料被廣泛用于食品添加劑、化妝品、飼料等方面，其需求量也逐年 呈大幅度增加趨勢。根據BBC Research公司發(fā)布的全球香精香料市場報告預測， 2011年將達78億美元。世界各國所用的香精香料也有差距,美國的食用香料種類 約為2000余種，歐盟的食用香料大約有3000余種，中國批準使用的食用香料大約 有1500多種。隨著人們生活質量的提高，消費者要求天然香料的愿望日益增加， 并希望獲得品質和性能更好的香料產品。奶味香精是食品工業(yè)中應用最廣泛的香精之一，酶解乳脂是食品工業(yè)中重 要的一種原料，目前應用廣泛且具有很大的應用潛力，如作為添加劑應用于焙烤 食品（面包、蛋

2、糕、曲奇等）、谷物食品（薄餅）、糖果（巧克力產品、太妃糖）、乳 制品（咖啡伴侶、糖霜、干酪、黃油）以及其他一些產品（調味品和點心）、乳制品 （發(fā)酵酸奶、調味奶）等。1天然香料根據美國聯邦法典規(guī)定，天然香料指“來源于天然物質的芳香油類、浸提 香精油、香料或凈油、蛋白水解物、餾出液以及食品通過烘焙、加熱或酶作用而 產生的含有香料的物質，其在食品中的主要功能是調香而非營養(yǎng)作用。這些天然 物質指香辛料、果汁、蔬菜或菜汁、食用酵母、草藥、樹木的根、莖、葉、芽或 類似的植物材料、肉類、海產類、禽蓄、蛋類、奶制品或發(fā)酵產品”。生物轉化法生產香料正好可以滿足這些要求，這些制備香精香料的生物方 法大致可分為以下

3、三類：一、生物催化法合成；二、借助微生物細胞發(fā)酵；三、 通過植物細胞或者組織提取。生物催化法是指采用生物催化劑，即酶作用于天然物質，通過合成或分解 反應而獲得天然香料的方法。生物催化法有許多優(yōu)點。首先，該法生產的香料是 全天然的；其次，采用的催化劑酶可在溫和的反應條件常溫、常壓和正常值范圍 下進行，且催化效率相當高，具有很強的立體專一性和區(qū)域、對應體選擇性;第 三，香料生成過程中的副產物少，易于分離純化，而且，即使有副產物，也是天 然無害的；第四，生物催化法能生產品種多樣的香料，幾乎所有的細胞成分都能 通過分解和合成反應產生香料物質。生物催化技術在香精香料應用方面，其中脂 肪酶（Lipase）

4、占很大比例。2脂肪酶的催化特性脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，其主要來源是微生物、哺乳動物、 植物。脂肪酶可催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、 轉酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現出其他一些酶的活性。作為一種 被廣泛應用的生物催化劑，其在生物、化學、制藥、食品、香料等各行業(yè)都有重 要應用。在香精香料行業(yè)中，生物催化由于具有反應條件溫和、高度選擇性、 產物純度高等優(yōu)點，可以完成很多化學反應不能達到的效果而被廣泛使用。不同來源的脂肪酶可催化同一反應，但在相同反應條件下，催化效率不同。 從已知結構的幾種脂肪酶來看，分子量在2000060000之間的脂肪酶作用在體系 的親

5、水-疏水界面層，這是區(qū)別于酯酶的一個特征。脂肪酶的催化部位含有親核 催化三聯體（Ser - His - Asp）或（Ser- His - Glu）。催化部位被埋在分子中， 表面被相對疏水的氨基酸殘基形成的a螺旋蓋狀結構覆蓋，對三聯體催化部位起 保護作用。界面活化現象可提高催化部位附近的疏水性，導致a螺旋再定向，從 而暴露出催化部位；界面的存在，還可以使酶形成不完全的水化層，這有利于疏 水性底物的脂肪族側鏈折疊到酶分子表面，使酶催化易于進行。3酶解機理乳脂肪的主要成分和脂肪酸甘油三醋（約占55%左右）、不飽和脂肪酸甘油 三醋（約占43%左右）、酮酸甘油三酯（約占1%左右）、羥酸甘油三醋（約占1%

6、 左右），這些脂肪酸甘油三醋在脂肪酶的作用下水解成各種飽和及不飽和脂肪酸， 其中C4、C6、C8、C10、C12、C14含量較豐富，它們具有較高的香氣貢獻度，是 構成乳香的主要因素。通常短鏈脂肪酸會產生干酪和奶油的香氣，而長鏈脂肪酸 對風味也起著重要的作用。短鏈脂肪酸與長鏈脂肪酸的比例也是影響酶解乳脂風 味的重要因素，同時它也能夠反映出酶解程度，即酶的利用率。B -酮酸在進一步 反應中又生成各種甲基酮類，主要有甲基戌酮、甲基庚酮、甲基壬酮、甲基十一 酮等等。羥酸生成各種6-內酯、Y-內酯，其中有6-辛內酯、&-內酯類、6- 十二內酯等偶碳內酯。雖然這些甲基酮類和6、y-內酯含量不高，但對形成奶

7、 香的貢獻卻很大。其反應式為：QHOH 卜 3RCOOHCH.OCOR I(1)C?HOCOR +3HQ型嘩CH.OC：OR脂肪酸甘油二能r水甘油+ 3R8OH脂肪酶(2)火-酮酸甘油三酯 /?-嗣酸.? ?謎一步反應：R - C-CH.-CGC.H -R - C - CH,P-酮醒汨基斕類4奶味香原料的制備工藝流程:5影響因素51脂肪酶的篩選脂肪酶簡稱脂酶，它分別來源于動物胰臟與微生物。用微生物的脂肪酶比較 經濟。其中有根霉(Rhigopus)、酵母菌(Yeast)、細菌(Bacteria)及放線菌 (Actinomyces)產生的脂肪酶。對奶香貢獻較大的為C4C12的脂肪酸，C16以上 的

8、飽和脂肪酸會帶來皂臭味等不良氣味從而影響最終的香氣質量，應盡量減少其 生成。不同微生物來源的脂肪酶由于酶活中心結構的差異，水解相同的甘油三酯 所表現出的脂肪酸特異性不同。選擇出對中短鏈脂肪酸具有較強水解能力的脂肪 酶，是制備純正、濃郁奶味香基的前提。5.2溫度7 1 40455D556065溫度也) 圖1溫度對酶解反應的影響酶類對溫度比較敏感，溫度過高會使脂肪酶鈍化;溫度過低會抑制酶的活性， 同時也會影響底物的黏度，從而影響傳質速度。從圖1來看，在4550C范圍內， 溫度的升高有利于反應的進行，酶促反應后風味也隨之增強；在50C下，酶促反 應的風味最佳。但過高的溫度對風味的生成也不利。這可能是

9、由于隨著溫度的升 高，脂肪酶變性失活的速度也迅速增加，在超過酶的適宜溫度范圍時，酶失活速 度比反應速度大得多，從而使酶促反應速度急劇下降。5.3催化時間用脂肪酶催化生成奶味香原料時，酶的作用時間對風味的形成也有較大的影 響。從理論上來說，酶促時間越長，脂肪酶酶解越徹底。實際上，由于脂肪酶解 過程比較復雜，過長的反應時間，可能會造成不良風味物質的生成增多，影響香 精的整體風味，所以不一定是時間越長越好，且浪費時間，增加成本。但如果作 用時間過短，使得反應程度不足，風味物質生成太少，風味沒有充分形成。所以要達到理想的風味，反應時間應控制好。5.4 pH值研究表明，有機相中酶最適pH與水相中酶催化的

10、最適pH是一致的。這樣在有 機溶劑中酶分子表面的必需水，在特定的pH和離子強度下，酶分子活性中心周圍 的基團處于最佳的離子化狀態(tài)，有利于酶活性的表現。酶在有機溶劑中能保持其 制備的pH不變，可記憶其制備時的pH。在用脂肪酶來催化生成奶味香原料時，體 系的pH對風味物質的生成有很大的影響。油脂的水解產物主要是脂肪酸，如果pH 過高，脂肪酸會與OH-反應生成脂肪鹽。在酸性條件下酶解和堿性條件下酶解，自 然會有不同的結果。5.5水如果底物在水中溶解性很差，或水是反應的一種產物，那么反應生成產物在 含水體系中產率一般很低Iwa i等用各種脂肪酸和萜醇在水體系中酯化的研究表 明，大多數脂肪酶沒有活性或活

11、性很低。水含量對脂肪酶的影響可以從兩個方面加以分析。一方面，酶需要少量的水 以保持活性的三維結構狀態(tài)，水可以保持催化部位的整體性、催化部位的極化、 蛋白質的穩(wěn)定。另一方面，水的存在限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性； 在酯化或水解反應中，水含量會影響反應的平衡點及產物在介質中的擴散，過量 水會導致酶的熱力學失活。脂肪酶適宜的含水量一必需水隨酶源不同會有明顯變 化。大量研究結果表明，有機介質中酶催化反應具有酶在水中所具備的優(yōu)點外， 還具有如下的特點：提高了非極性底物的溶解度；熱力學平衡向合成方向移 動；抑制了有水參與的副反應；酶易回收再利用；容易從低沸點的有機溶 劑中分離純化產物；熱穩(wěn)定性顯著

12、提高，pH的適應性擴大；無微生物的污染。所謂非水介質并不是絕對無水，酶維持活性有賴于其活性構象的維持，而酶 的活性構象的形成是依賴于各種氫鍵、疏水鍵等非共價相互作用。水參與了氫鍵 的形成，而疏水相互作用也只有在有水參與時才能形成。因此，水分子與酶分子 的活性構象形成有關。其實與酶分子起作用的只是與酶分子緊密接觸的一層束縛 水，只要保證這些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分 的自由水盡可以被有機溶劑所代替。5.6酶添加量圖4酶量對酶解反應的影響脂肪酶催化生成奶味香原料時，其用量對風味有較大影響。脂肪酶用量少時， 風味物質生成量少，奶味較淡；用量過多，雖然可以生成大量的風味物質

13、，但會 引起其他不良現象的產生，如產生不良的風味；再者，由于酶用量過多，也會增 加生產成本。5.7酶載體由于脂肪酶價格昂貴，因此，酶再生與再利用是必須解決的問題。固定化脂 肪酶在一定程度上可減少溶劑導致的酶失活，可以使酶在反應介質中均勻存在， 存在的主要問題是由于酶的失活及解吸，酶活性隨循環(huán)次數而下降。載體材料一般要求有較高的機械強度；由于有機溶劑的存在，要求有較高的 化學隋性；載體材料應易于酶活性再生；載體材料影響酶附近的水含量，材料上 吸附適當的水對保持酶活性有益；載體材料還會影響反應物和產物的分配。6當前研究進展6.1超臨界流體狀態(tài)下的酶反應超臨界流體狀態(tài)下的酶反應是近幾年來生物工程新開

14、拓的領域。超臨界流體 具有類似液體的密度，類似氣體的擴散性和粘度，因此顯示出較大的溶解能力和 較高的傳遞特性，從而大大降低酶反應過程的傳質阻力，提高酶反應速率；反應 底物的溶解性對超臨界的操作條件（如溫度、壓力）特別敏感，通過簡單改變操 作條件或附加其它設備就可達到反應產物和底物、副產物分離的目的。在酶催化 領域，通過采用超臨界CO2作溶劑，它具有無毒、不可燃、化學惰性、易與反應 底物分離、價格便宜等特點，可克服有機溶劑的毒性及價格高的缺點，且高壓連 續(xù)式的反應操作更是有利于工業(yè)化的生產。Hammard等率先提出了超臨界CO2可作為酶法酯交換反應介質，接著Nakamura 報道了脂肪酶催化甘油

15、三酯酶交換反應的研究結果。越來越多的研究顯示了超臨 界CO2下脂酶催化的反應具有廣闊應用前景。6.2微生物發(fā)酵與酶法結合目前酶法是生產天然奶味香原料的常用方法，但酶法制備的奶味香原料多以 中短鏈游離脂肪酸為主要香氣成分，香氣強度大，但香型單調，容易出現油味及 酸敗味。利用微生物發(fā)酵法生產食品香料近幾年發(fā)展較快，微生物代謝過程中發(fā) 生一系列復雜的反應，產生的香氣柔和更宜被大眾接受，但風味物質發(fā)酵產率較 低，香氣強度不夠。因此將微生物發(fā)酵與酶法相結合是制備高質量天然奶味香原 料的重要途徑。奶味香氣的特征香氣化合物以丁二酮、3羥基丁酮（乙偶姻） 為主，丁二酮可通過乳酸菌發(fā)酵產生。目前國內外的研究主要集中在如何提高發(fā)酵乳中丁二酮含量方面，而較少將 微生物發(fā)酵合成丁二酮的方法應用到天然香精香料的研制中。有學者研究選用具 有合成丁二酮能力的乳酸菌株為發(fā)酵菌株，以全脂乳為發(fā)酵原料并進一步利用脂 肪酶對發(fā)酵液進行修飾，制備奶香純正、濃郁的