1、蛋白質(zhì)濃度的測定一.紫外吸收法近紫外吸收光譜法(280 nm )原理：蛋白質(zhì)中含有色氨酸與酪氨酸殘基，這兩種氨基酸殘基具有吸收紫外光的 性質(zhì)，它們的紫外光吸收譜峰值在280 nm附近。近紫外吸收法就是根據(jù)這個(gè)性 質(zhì)，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)中所含有的色氨酸與酪氨酸的數(shù)量存 在很大的差異，所以蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度A280也存在非常大的差異。比 如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1mg/ml時(shí)，吸光度A280可為0-4之間的任何值。但是，大 部分的蛋白質(zhì)的吸光度A280時(shí)0.5-1.5之間的某個(gè)值。該方法測定蛋白質(zhì)的濃度具有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。這種方法操作簡單，測定完成后， 樣品可以被回收，對buf

2、fer沒有特殊要求，這是該方法的優(yōu)點(diǎn)。該方法的缺點(diǎn)是： 其他的生色基團(tuán)會影響蛋白質(zhì)吸收光譜的測定，比如核酸在該波長的紫外吸收能 力非常強(qiáng)，少量的核酸就會對蛋白質(zhì)吸光值的測定造成很大的干擾。同時(shí)，不同 的蛋白質(zhì)的消光系數(shù)需要在實(shí)驗(yàn)前確定。蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算：朗伯比爾定律：A (absorbance) = c l，因此： c( mg/ml)= A/s l (cm)o消光系數(shù)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1 mg/ml ,光徑為1 cm時(shí)，所測得的吸收值為該蛋白 質(zhì)的消光系數(shù)。蛋白質(zhì)的消光系數(shù)計(jì)算公式：A280(1 mg/mL) = (5690n w + 1280ny+ 120nc)/M。其 中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，

3、5690、1280與120分別是色氨酸、酪氨酸與半胱氨酸的消光系數(shù)，n是該氨基酸殘基的數(shù)目。遠(yuǎn)紫外吸收光譜法在190-210 nm范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)中的肽鍵具有非常強(qiáng)的吸收紫外光的能力。此波 長范圍內(nèi)，肽鍵在190 nm處的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm， 氧氣對紫外光的吸收非常強(qiáng)，因此，通常取205 nm處的吸收值對蛋白質(zhì)進(jìn)行定 量。對于1 mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，它們的消光系數(shù)通常在30-35之間。對于不同 的蛋白質(zhì)，其消光系數(shù)差別很小。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，靈敏度高，樣品可以回收。缺點(diǎn)：在使用前，必須對 分光光度計(jì)進(jìn)行準(zhǔn)確校正，多種buffer，heme or pyri

4、doxal groups在該波長具有 很強(qiáng)的吸收紫外光的能力。測定：用生理鹽水溶解蛋白質(zhì)樣品，確保其在215 nm處的吸收值小于1.5。磷酸鉀buffer不影響吸收值的測定。計(jì)算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205)或 Protein concentration (pg/mL)= 144 (A215 225)。Notes:使用這兩個(gè)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時(shí)，最佳的吸收值范圍為0.05-1，當(dāng)吸收值 為0.3時(shí)，測定的結(jié)果最精確。如果樣品渾濁，可以扣除310 nm處的吸收值。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度很低時(shí)，蛋白質(zhì)可能會吸附在石英杯內(nèi)壁，從而影響蛋白質(zhì)濃度的測定，在溶液中提高離

5、子強(qiáng)度或者添加非離子型去垢劑可以防止這種現(xiàn)象的發(fā)生。1 mg/ml的BSA的吸收值為0.06，通常作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)溶液中存在核酸時(shí)，可以用下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：Protein (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51Protein (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51Protein (mg/mL) = 0.183 A230 - 0.0758 A260當(dāng)吸收值小于2時(shí)，在215 nm處測定的吸收值符合朗伯比爾定律。在 215 nm處進(jìn)行測定時(shí) sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate, and

6、 Tris 不會影響吸收值的測定，但是 0.1 M acetate, succinate, citrate, phthalate, and barbiturate 具有很強(qiáng)的吸收值。在pH4-8的范圍內(nèi)，215-225 nm的吸收值沒有變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中存在核酸時(shí)，也可以這樣計(jì)算：protein concentration (inmg/ml) =F x A280 (assuming the cuvette is 1 cm wide).Poponton of傷80460nucfefc 珈 F001 4 3 J. .06加.02朋1 1 1- o5 0 5 0 .25 ?.& o.o.o 13 2 0 6 .6S-43.9Ji 9 2 44 9 5 19 8 5 CD a o Qo.Av B Jo 四 3 J.nJO.o3 2 64 8 57 78O.QO.O.07 AUJ- d 6? 3 7 49 o B R o-o.o-o.7 5 50 8 66 8 5 5 o.a ao.o w fl .Q5.