1、第十六章 細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老 第一節(jié) 細(xì)胞死亡 第二節(jié) 細(xì)胞衰老死亡是生命的普遍現(xiàn)象，但細(xì)胞死亡并非與機(jī)體死亡同步。正常的組織中也發(fā)生細(xì)胞死亡，它是維持組織機(jī)能和形態(tài)所必需的。 一、細(xì)胞的死亡方式（一）細(xì)胞壞死（二）細(xì)胞凋亡（三）自噬研究發(fā)現(xiàn)，不論單細(xì)胞還是多細(xì)胞生物，細(xì)胞死亡往往是一個主動的有基因決定的自動結(jié)束生命的過程。由于受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以常常被稱為細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）（一）細(xì)胞凋亡1、細(xì)胞凋亡的概念和特征1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞這些的溶酶體并未被破壞，

2、顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍的組織中脫落并被吞噬機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念， 細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。形態(tài)學(xué)3個階段：凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某 些

3、細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體。凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化。整個過程最大的特點(diǎn)是質(zhì)膜始終保持完整，內(nèi)含物不發(fā)生細(xì)胞外泄露，不引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡的生化特征細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為 180200bp特征性的DNA ladders 凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）積累并達(dá)到較高水平細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h4細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3 h5細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4 h6陰性對照7Marker2、細(xì)胞

4、凋亡生理意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物的個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持、免疫耐受的形成、腫瘤監(jiān)控等過程中都起著非常關(guān)鍵的作用。（1）清除有機(jī)體不再需要的細(xì)胞，而不引起炎癥反應(yīng)。（2）細(xì)胞的自然更新，清除被病原體感染的細(xì)胞（3）免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊并引起死亡，也是基于細(xì)胞凋亡（4）細(xì)胞凋亡失調(diào)會導(dǎo)致疾病蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡，2）脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育3）發(fā)育過程中手和足的成形過程4)細(xì)胞調(diào)亡的失調(diào)（不恰當(dāng)?shù)募せ罨蛞种疲┘?xì)胞凋亡不足：ALPS（自身免疫性淋巴增生綜合征）細(xì)胞過度凋亡將會導(dǎo)致免疫功能喪失，AIDS3、細(xì)胞凋亡的檢測形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察DNA電泳：D

5、NA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法彗星電泳法（comet assay）流式細(xì)胞分析 根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA 產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì) 胞，同時又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。4、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制1）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子物理性因子，包括射線（紫外線， 射線等）， 較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等?；瘜W(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫 瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等。Caspase依賴性細(xì)胞凋亡不依賴Caspase的細(xì)胞凋亡2） Caspa

6、seCaspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific protease（天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶），即CaspaseCaspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化秀麗隱桿線蟲(Caenorbabditis Elegans)從胚胎發(fā)育到成體產(chǎn)生1090個細(xì)胞，其中131個細(xì)胞凋亡后消失，找到一系列與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因 ced-3、ced-4 誘發(fā)、啟動凋亡， ced-9 抑制凋亡 ced-3、ced

7、-4 基因突變或缺失，使凋亡受阻 移入 ced-9 使凋亡受阻 失去 ced-9 使細(xì)胞凋亡Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme，白介素-1 -轉(zhuǎn)換酶)，即Caspase1。ced-3 和ced-4是細(xì)胞殺手;ced-9可抵消ced-3和ced-4 的作用，防止細(xì)胞被殺死，因此是存活因子; 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)真正的細(xì)胞殺手是ced-3而不是ced-4。caspase家族成員基本功能Caspase1Caspase11 不直接參與細(xì)胞凋亡信號的傳導(dǎo)Caspase4Caspase2Caspase8Caspase9Caspase10Caspase3

8、Caspase6caspase7參與細(xì)胞凋亡的起始對執(zhí)行者的前體切割，產(chǎn)生有活性的執(zhí)行者參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行：切割結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白3）Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。下游Caspases活化后，作用底物： 裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體； 裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNA Ladder; 裂解參與細(xì)胞連接或附著的

9、骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、 脫落，便于細(xì)胞吞噬； 導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。Bcl-2, Bcl-x, Bcl-w,抑制細(xì)胞凋亡，Bax,Bak,Noxa促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2, Bcl-x與 Bax,Bak形成異二聚體，通過抑制Bax和Bak寡聚體化來抑制膜通道的開啟。凋亡信號Bax,Bak聚集、轉(zhuǎn)移到Mt膜上與VDAC作用通道開放，Cytc釋放啟動細(xì)胞凋亡）Caspase非依賴的細(xì)胞調(diào)亡）生死抉擇：細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞中存在Caspase抑制因子，能夠直接與Caspase 活性分子結(jié)合，抑制其底物的切割作用。如：c-IAP，BARIAP特異性地與執(zhí)行Caspase-3

10、和Caspase-7的活化形式結(jié)合，發(fā)揮抑制作用XIAP,ILP-2和Linvin能抑制起始Caspase-9c-FLIP,BAR,ARC能夠抑制死亡受體對Caspase-8的激活。IAP家族成員的抗凋亡作用也能被特異的抑制因子解除。凋亡啟動后，Smac/DIABLO和Omi/HtrA2與Cytc一起從Mt中釋放出來，與IAP結(jié)合并釋放被IAP封閉的Caspase.天花病毒CrmA抑制Caspase-8桿病毒p35對大多數(shù)Caspase有較強(qiáng)的抑制作用。皰疹病毒和痘病毒c-FLIP,含有兩個DED結(jié)構(gòu)域，可與死亡受體Fas的接頭蛋白FADD作用，阻止Caspase-8與FADD結(jié)合及活化，來抑

11、制凋亡。6）細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)NF-kB是細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子它的靶基因是TRAF，IAPS等，這些基因的表達(dá)蛋白能抑制Caspase8的活性從而抑制細(xì)胞凋亡。Ras活化NF-Kb， NF-kB通過調(diào)控靶基因表達(dá)蛋白，抑制Caspase8的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。p53是腫瘤抑制基因，可以阻斷細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。長期以來人們認(rèn)識到細(xì)胞在DNA損傷后便停止DNA復(fù)制，這是P53蛋白表達(dá)、聚集并進(jìn)一步上調(diào)一系列基因表達(dá)的結(jié)果。 P21便是其中之一, P21具有抑制細(xì)胞周期素/細(xì)胞周期素依賴性激酶的底物磷酸化作用，導(dǎo)致G1期阻滯，使細(xì)胞贏得時間，在進(jìn)入S期前修復(fù)損傷的DNA。 如果損傷不

12、能修復(fù)，P53就激活那些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。當(dāng)P53基因發(fā)生缺失或異常時，P53失去對細(xì)胞的監(jiān)視作用，帶著損傷的DNA進(jìn)入S期，其結(jié)果是細(xì)胞因遺傳不穩(wěn)定性而產(chǎn)生突變和染色體畸變，最后導(dǎo)致細(xì)胞癌變。 ，P53基因產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可提供一種防護(hù)機(jī)制，使DNA損傷的細(xì)胞不能存活，而走向程序性死亡。（二）細(xì)胞壞死：可能是細(xì)胞程序性死亡的另一種形式。壞死的早期階段,染色體形成串狀片段,細(xì)胞器膨脹 ，壞死的最后階段,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞解體,內(nèi)容物散逸。（三）細(xì)胞自噬：細(xì)胞中出現(xiàn)大的來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中雙層膜包裹的自噬泡，成為自噬小體。自噬小體包裹著整個細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)，且與容酶體

13、融合后，內(nèi)含物被容酶體中的水解酶消化。二、植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡（一）植物細(xì)胞的程序性死亡1）概述：導(dǎo)管的分化、通氣組織的形成，糊粉層的退化，絨氈細(xì)胞的死亡，胚胎發(fā)育過程中胚柄的退化，單性植物中花器官的程序性退化等過程以及對環(huán)境脅迫的反應(yīng)，均存在細(xì)胞程序性死亡。另細(xì)胞在受到某些真菌或細(xì)菌感染后主動、快速死亡，也是細(xì)胞的程序性死亡2）特征：死亡細(xì)胞的殘余物被細(xì)胞壁固定在原位。在過敏反應(yīng)中：染色質(zhì)凝縮，DNA降解為50kb片段，細(xì)胞質(zhì)膜與液泡膜皺縮破裂，質(zhì)壁分離，內(nèi)涵物泄露。管狀細(xì)胞分化：細(xì)胞壁增厚，液泡膜破裂，核 DNA被迅速降解，內(nèi)涵物被水解，最后僅剩下細(xì)胞壁。3）誘導(dǎo)因素：活性氧和植

14、物激素（二）酵母細(xì)胞的程序性死亡1）特征：DNA凝聚、邊緣化和斷裂，Cytc從Mt中的釋放。Yca1的缺失降低了酵母細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性。Nma111在核內(nèi)聚集，引發(fā)凋亡。“主動自殺”清除適應(yīng)不良的個體以及控制群體數(shù)量，第二節(jié) 細(xì)胞衰老一、細(xì)胞衰老的概念及特征 現(xiàn)代人類面臨著3種衰老：生理性衰老病理性衰老心理性衰老 衰老(senescing，aging)是機(jī)體在退化時期生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn),是不可逆的生命過程。人的衰老與細(xì)胞的衰老相關(guān)聯(lián)。Hayflick界限概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的 壽命；它們的增殖能力不是無

15、限的，而是有一定的界限，這就是 Hayflick界限癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài) 已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞。細(xì)胞來源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù) 40-60 20 2-4不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來自胎兒： 可傳代 50 次 （與供體年齡 來自成人； 可傳代 20 次 有關(guān)）來自小鼠： 可傳代 1428 次 （與供體物種來自烏龜： 可傳代 90125 次 特性有關(guān)）物種的壽命與體外培養(yǎng)時細(xì)胞傳代次數(shù)的關(guān)系 Hayflick的一些經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1、 從胎兒肺取到的成纖維細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下傳代50次。而從成人肺取到的成纖維

16、細(xì)胞只能傳代20次，可見細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)。2 、1961年Hayflick等觀察到在人二倍體成纖維細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)時，增殖能力有一定限度。正常細(xì)胞培養(yǎng)到一定時期，會出現(xiàn)生長停滯，漸漸失去有絲分裂的能力并在細(xì)胞內(nèi)積累大量碎片和顆粒，最終難免死亡。海弗立克認(rèn)為這是人的壽命在細(xì)胞水平的表示。Hayflick還比較取自壽命長度不同的生物的胚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的傳代次數(shù)和壽命的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著確定的相互關(guān)系。3、 早老癥病人細(xì)胞培養(yǎng)只傳代2-4次4、用巴氏小體做標(biāo)記老男和少女細(xì)胞的培養(yǎng)，證明細(xì)胞內(nèi)部決定衰老5 、胞質(zhì)體和完整細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn) 證明是細(xì)胞核決定

17、衰老Hayflick得出這樣的結(jié)論細(xì)胞、至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的而是有一定壽命的。它們的增殖能力不是無限的，而是有一定界限的。這就是有名的Hayflick界限。細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在 個體發(fā)育的早期也會發(fā)生;人體和動物的各種器官和組織都是由細(xì)胞組成的，整體水平的老化是機(jī)體各部分組織細(xì)胞老化的總的反映。從五官的感覺功能的老年性退化，如人眼的視力調(diào)節(jié)能力隨年齡而降低，到老年性疾病引起死亡率的提高，如腎、心、腦組織中血管的故障、骨質(zhì)疏松、肺功能和免疫功能的缺陷等等，都是以細(xì)胞發(fā)生的變化為基礎(chǔ)的。一名男子從 36 歲到 75 歲味覺喪失 64腎小球減少

18、 44腎小球過濾率減少 31脊神經(jīng)元減少 37神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢 10腦供血量減少 20肺活量減少 441 小鼠的表皮移植表皮移植7-8年，說明體內(nèi)環(huán)境因素影響了細(xì)胞的壽命2 骨髓移植說明骨髓干細(xì)胞的衰老至少是緩慢的（一）衰老過程中細(xì)胞核的變化在衰老變化中細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的最明顯變化是核膜內(nèi)折。電鏡檢測可見衰老細(xì)胞核形狀不規(guī)則、內(nèi)陷和斷裂。在體內(nèi)細(xì)胞中也觀察到核膜的不同程度的內(nèi)折，神經(jīng)細(xì)胞尤為明顯，這種內(nèi)折隨年齡增長而增加，最后可能導(dǎo)致核膜崩解。染色體固縮化是衰老細(xì)胞核中另一個重要變化。在衰老細(xì)胞中，細(xì)胞核固縮，還常常出現(xiàn)核內(nèi)容物，核質(zhì)染色加深，核的細(xì)致結(jié)構(gòu)逐漸消失，核仁也發(fā)生明顯的變化。 （二）內(nèi)質(zhì)

19、網(wǎng)的變化在衰老細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列變得無序，膜腔膨脹擴(kuò)大甚至崩解，膜面上核糖體數(shù)量減少。（三）衰老過程中線粒體的變化 多數(shù)研究工作表明，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，而其體積則隨著年齡的增長而增大。衰老的神經(jīng)元，肝臟細(xì)胞和肌細(xì)胞的線粒體數(shù)目減少，但體積增大。同時，線粒體的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，腫脹空泡化，內(nèi)部嵴大大減少。線粒體崩解是細(xì)胞衰老變化的重要標(biāo)志。線粒體變化主要是自由基損傷的結(jié)果，因?yàn)榫€粒體的呼吸鏈?zhǔn)菗p傷性自由基的發(fā)源地。線粒體DNA成為自由基的主要攻擊目標(biāo)，使線粒體DNA呈逐漸減少或使線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物逐漸減少，直接影響與線粒體呼吸和能量轉(zhuǎn)換過程有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成，造成ATP合

20、成和細(xì)胞能量供應(yīng)不足，引起細(xì)胞功能紊亂，直到細(xì)胞死亡。 （四） 致密體的生成是衰老細(xì)胞中常見的結(jié)構(gòu)。（五）膜體系的變化1、細(xì)胞的間隙連接明顯減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小，這種變化使細(xì)胞間代謝協(xié)作減少了。2、細(xì)胞膜上的微絨毛數(shù)目增加，補(bǔ)償了衰老時細(xì)胞間聯(lián)系的衰退，以利于保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。3、膜脂相發(fā)生改變，不飽和脂肪酸含量增加，膜流動性下降。年輕的功能健全的細(xì)胞膜是典型的液晶相，膜中脂肪酸鏈能自由移動，每個脂類分子與其相鄰分子之間的位置交換極其頻繁，鑲嵌于其中的蛋白分子表現(xiàn)出最大的生物學(xué)活性。衰老的或有缺陷的膜通常處于凝膠相或固相，由于磷脂的脂肪酸尾不飽和程度增加而被“凍結(jié)”了，脂分子

21、移動很慢或完全不能自由移動。因此鑲嵌于其中的蛋白質(zhì)也就不能再運(yùn)動了，從而干擾了膜蛋白的正常結(jié)構(gòu)與功能。衰老細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，流動性明顯降低，因而細(xì)胞的興奮性降低，離子轉(zhuǎn)運(yùn)的效率下降以及對內(nèi)源性和外源性刺激的反應(yīng)性也隨之降低。膜的微粘度增加，從而影響膜表面受體的移動和特異性生物化學(xué)信號的傳導(dǎo)。二、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制 細(xì)胞的衰老（senescence）現(xiàn)在關(guān)于細(xì)胞衰老的分子機(jī)制的研究，引起人們關(guān)注的有染色體端粒復(fù)制和線粒體自由基的假說。（一）復(fù)制衰老的機(jī)制發(fā)現(xiàn)端粒長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的 “有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990）端粒是由簡單的富含T和G的DNA片段的重復(fù)序列組成。人類端粒結(jié)構(gòu)為染色體末端重復(fù)上千次的TTAGGG序列所組成。DNA聚合酶不能完成線性染色體末端DNA的復(fù)制，由于RNA引物的原因，DNA聚合酶一定會留下染色體末端的一段DNA（一段端粒）使其不被復(fù)制。那么真核細(xì)胞染色體末端的端粒就會隨著細(xì)胞分裂而縮短。這個縮短的端粒傳給子細(xì)