1、.：.；3.RNAi病毒包裝3.1腺病毒包裝3.1.1特點(diǎn)：幾乎可以感染一切類型的細(xì)胞?？梢垣@得復(fù)制缺陷型 (E1和E3缺失) 的腺病毒。病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以到達(dá)1012 PFU/mL，能有效的進(jìn)展增殖。腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物平安性高。3.1.2原理：腺病毒 (Adenovirus，Ad) 是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制才干。這些重組病毒僅在高程

2、度表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。3.1.3腺病毒包裝簡要流程 (以Invitrogen包裝系統(tǒng)為例)構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體。采用PacI消化純化的質(zhì)粒。消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。分裝，- 80 oC保管。 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。3.1.4 本公司提供的最終產(chǎn)品包括：重組后的腺病毒載體質(zhì)粒以及測序圖譜。產(chǎn)品無菌檢測結(jié)果。腺病毒儲(chǔ)液及相應(yīng)的病毒滴度。我們保證：1) 制備的病毒顆粒攜帶片段的正確性2) 病毒顆粒的總數(shù)和病毒滴度：如無特殊要求我們提供

3、1mL滴度為11010 - 11012個(gè)病毒基因組 / mL的病毒儲(chǔ)液。3.2慢病毒載體包裝效力3.2.1特點(diǎn)： 直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適宜RNAi研討和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 (比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。可以經(jīng)過簡一方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研討。無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便?？梢愿鶕?jù)客戶需求制備多種標(biāo)志。3.2.2原理：慢病毒Lentivirus是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，一方面

4、可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體運(yùn)用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依托傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂形狀的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)展長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。3.2.3慢病毒包裝簡要流程：含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞。培育48hrs - 72hrs左右，搜集含有病毒的上清培育液。病毒的純化和濃縮。分裝、- 80 oC保管。滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。3.2.4本公司提供的最終產(chǎn)品包括：重組后的慢病毒載體質(zhì)粒以及測序圖譜。產(chǎn)品

5、無菌檢測結(jié)果。慢病毒儲(chǔ)液及相應(yīng)的病毒滴度。我們保證：1) 制備的病毒顆粒攜帶片段的正確性2) 病毒顆粒的總數(shù)和病毒滴度：如無特殊要求我們提供1mL滴度為1107 - 1108 / mL的病毒儲(chǔ)液。3.3其他類型病毒載體包裝病毒包裝的siRNA基因能否對(duì)目的靶基因進(jìn)展有效基因沉默，依賴于外源基因在受體中高效、穩(wěn)定的表達(dá)，而這在很大程度上取決所采用的載體系統(tǒng)。本公司除了可以進(jìn)展腺病毒包裝和慢病毒包裝，還可以進(jìn)展其他類型病毒包裝 (逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝、腺相關(guān)病毒包裝等)。3.3.1逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒 (Retrovirus) 是一類知的RNA病毒。需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，

6、再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。該載體系統(tǒng)有兩部分組成，一是帶有外源基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體分子，二是能以反式提供病毒構(gòu)造蛋白的包裝細(xì)胞，其要求是能高效產(chǎn)生感染靶細(xì)胞的重組病毒顆粒，且無野生型的反轉(zhuǎn)錄病毒存在，后者是基因治療平安性的關(guān)鍵問題。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體最大優(yōu)點(diǎn)是: (1) 轉(zhuǎn)染范圍廣，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等; (2) 轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合; (3) 對(duì)細(xì)胞感染率高，到達(dá)100 %; (4) 感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期繼續(xù)表達(dá)外源基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺乏之處，如: (1) 只能整合至分裂期細(xì)胞; (2) 可插入外源基因片斷小10kb，難以滿足較大基因的插入; (3) 病毒滴度是限制臨床運(yùn)用的主要方面;(4) 有產(chǎn)生野生型病毒或輔助型病毒的能夠，隨機(jī)整合能夠產(chǎn)生不良作用。 3.3.1腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒因其能將外源基因定點(diǎn)整合至宿主細(xì)胞上，因此具有普通病毒載體所不具有的特性。腺相關(guān)病毒Adeno - associated virus，AAV單鏈DNA病毒，是一種缺陷型病毒，只需與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時(shí)才干進(jìn)展有效復(fù)制。與其他載體病毒相比，腺相關(guān)病毒的特點(diǎn)：(1) AAV無致病性，并且在受染體上不會(huì)引發(fā)免疫反響; (2) 宿主范圍廣，并可感染非分裂細(xì)胞; (3)