1、關(guān)于重組及重組技術(shù)第一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA重組（DNA recombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。 第二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature第三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA重組同源重組 (homol

2、ogous recombination)位點特異性重組(site-specific recombination)轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)第四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（general recombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.col

3、i的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式第五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Holliday模型的4個關(guān)鍵步驟： 兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patch recombinant)拼接重組體(splice recombinant) 一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：第六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月片段重組體 （見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條

4、鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。 第七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。 RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。 RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識別Holliday連接點，并有選擇地切開同源重組體的中間

5、體。 第八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holliday中間體53535353第九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Holliday中間體535353535535533335555333355553335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體片段重組體第十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、位點特異重組是發(fā)生

6、在特異位點間的DNA整合位點特異性重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。第十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）噬菌體DNA的整合第十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）細(xì)菌的位點特異性重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月hix為反向重復(fù)序列，它們之間

7、的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達(dá)，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。 輕鏈

8、的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 第十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列基因片段第十七張，PPT共九十三

9、頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫球蛋白基因重排過程第十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。 第十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 插入序列(insertion sequences, IS)組成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transpo

10、sase)編碼基因第二十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)第二十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座第二十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。IRIRTransposase Gene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因第二十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月

11、 細(xì)菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L第二十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第二十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、原核細(xì)胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用 當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。第二十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月可接合質(zhì)粒如 F 因

12、子(F factor) 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒第二十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。第二十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。第二十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。第三十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)

13、作于2022年6月噬菌體的生活史溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway)第三十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 重組DNA技術(shù)Recombinant DNA Technology第三十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。19

14、80年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。第三十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。 DNA克隆第三十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克?。?細(xì)胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮┑谌鍙垼琍PT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA

15、分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。╩olecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工程（genetic engineering）技術(shù)第三十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 目的： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）第三十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶第三十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重組D

16、NA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接；缺口平移制作高比活探針； DNA序列分析；填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同

17、質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第三十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列，并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定義：第四十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。、（基因工程技術(shù)中常用型）分類：作用：第四十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第一個字母取自產(chǎn)生該酶

18、的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第四十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第四十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口第四十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年

19、6月有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶第四十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同裂酶：第四十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月名稱

20、 識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生突出末端:BamH 5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后產(chǎn)生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶第四十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2

21、022年6月 二、重組DNA技術(shù)中常用的載體 定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 載體按功能分為 克隆載體(cloning vector) 表達(dá)載體(expression vector) 第四十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。第四十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）克隆載體至少有一個復(fù)制起點使載體在宿

22、主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增。至少有一個選擇標(biāo)志（selection marker）：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的RE的單一切點：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個RE的單一切點，可供外源基因插入時選擇，叫多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）。1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點 第五十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）質(zhì)粒 (plasmid)特點: 存在于細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu)。能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨

23、立自主復(fù)制，帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 2. 常用的克隆載體 第五十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC18質(zhì)粒載體圖譜 第五十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組DNA克隆）（2）噬菌體DNA(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第五十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體） 酵母人工染色體 (yeast artifi

24、cial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體第五十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）表達(dá)載體表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同分為：原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體第五十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 原核表達(dá)載體 原核表達(dá)載體的基本組成 R：調(diào)節(jié)序列；P：啟動子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列第五十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 真核表達(dá)

25、載體 真核表達(dá)載體的基本組成 OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。第五十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟第五十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程第六十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）目的的分離獲取分化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。從基因組DNA文庫和c

26、DNA文庫中獲取目的DNA (見第20章) PCR法 (見第20章) 其他方法 (見第20章) 第六十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第六十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因第六十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA

27、限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫 第六十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T第六十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）載體的選擇與構(gòu)建選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體

28、的選擇和改建方法也不同。 目的： 獲得某一目的基因或DNA片段 獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)第六十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒510kb細(xì)菌，酵母噬菌體載體20kb細(xì)菌黏粒50 kb細(xì)菌BAC400kb細(xì)菌YAC3 Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞 第六十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）目的DNA與載體連接接方式：（1）單一相同黏端連接 （2）不同黏端連接 （3）通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接 黏端連接第六十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15C

29、GATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連單一相同黏端連接第六十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月不同黏端連接（定向克?。〦co R切割位點Bg l切割位點+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體第七十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭(linker)連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接第七十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3

30、-Eco REco REco REco R第七十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。 同聚物加尾連接第七十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體5

31、第七十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR法針對目的DNA的5-和3-端，設(shè)計一對特異引物，在每條引物的5-端分別加上不同的RE位點，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應(yīng)RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。第七十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：第七十六張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連第七十七張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于20

32、22年6月3. 粘-平末端連接黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。 屬于定向克隆第七十八張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)第七十九張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選（初篩） (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2) 利用基因的插入失活/插入表達(dá) 特性篩選(3) 利用標(biāo)志補救篩選(4)利用噬菌

33、體的包裝特性進(jìn)行篩選（五）重組體的篩選與鑒定篩第八十張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 序列特異性篩選 (1) RE酶切法(2) PCR法 (3) 核酸雜交法(4) DNA測序法 3. 親和篩選法第八十一張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月插入失活篩選帶有重組載體的克隆 第八十二張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月互補篩選（藍(lán)-白篩選） 第八十三張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月菌落或噬斑原位雜交篩選重組體 第八十四張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)分分離獲取目的基因 選載體的選擇與構(gòu)建接目的DNA與載體連接 轉(zhuǎn)重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩重組體的篩選與鑒定第八十五張，PPT共九十三頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒