1、精品文檔細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)分泌的蛋白質(zhì) ,在體內(nèi)廣泛參與免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、刺激造血系統(tǒng)、刺激細(xì)胞的增殖與凋亡等重要生理活動(dòng),?在抵抗外來病原及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可導(dǎo)致一些細(xì)胞因子超量表達(dá),或表達(dá)減少 ,從而參與疾病的發(fā)病及病理過程。1、免疫學(xué)檢測(cè)法其基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測(cè)。?如免疫斑點(diǎn)法、 ELISA 法、 RIA 法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。2.、生物學(xué)測(cè)定法其原理是根據(jù)細(xì)胞因子對(duì)特定的依賴性細(xì)胞株(即靶細(xì)胞 )?的促增殖作用 ,以增殖細(xì)胞中的DNA 的合

2、成或酶活性為指標(biāo) ,間接推算出細(xì)胞因子的活性單位 ,如對(duì) IL-1 、 IL-2 等細(xì)胞因子活性的檢測(cè)。亦可根據(jù)某些細(xì)胞因子對(duì)特定靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)或?qū)Σ《镜囊种谱饔眠M(jìn)行測(cè)定,如對(duì)腫瘤壞死因子及干擾素的生物活性測(cè)定。3、分子生物學(xué)測(cè)定法目前采用的技術(shù)有各種印跡法、斑點(diǎn)雜交、原位雜交和PCR 等。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或mRNA 量 ,推算出細(xì)胞因子的合成量。.精品文檔一、 IL-1 的檢測(cè) (生物活性測(cè)定 )產(chǎn)生 IL-1 的細(xì)胞種類很多 ,其中最主要的為單核 - 巨噬細(xì)胞。 IL-1 可分為 IL-1 (?也稱酸性 IL-1,pI=5.0) 和 IL-1 (中性 IL-1,pI=7.

3、0) 。兩者的分子量和生物活性相似 ,?只能用抗體檢測(cè)方法才能區(qū)別 ,常用的生物學(xué)測(cè)定法對(duì)兩者都適用。 IL-1?的生物學(xué)活性廣泛 ,其檢測(cè)方法亦較多 ,包括有小鼠胸腺細(xì)胞增殖法、 D10G 4.1 細(xì)胞增殖法及 L929 細(xì)胞增殖法等。IL-1 反應(yīng)細(xì)胞增殖可以通過活性染料染色 ,顯微鏡直接計(jì)數(shù) ,3H-TdR 或 125I-UdR 的 DNA 摻入量或以活性細(xì)胞代謝率為指標(biāo)來表示。本試驗(yàn)介紹 L929 細(xì)胞增殖 MTT 比色法。（一） IL-1 的誘生體外試驗(yàn)可用 LPS 等有絲分裂原誘導(dǎo)單核 - 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1, 或用P388D1( 鼠),THP-1( 人)細(xì)胞株制備 IL-1

4、。本試驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞制備IL-1 。1、取 610 周齡 BALB/c 或 C57BL/6 小鼠 ,雌雄均可 ,拉頸處死后用酒精消毒。2、用帶 9 號(hào)針頭的 5ml 注射器腹腔注入5ml 冷的含 5小牛血清的 Hanks 液(5?NBS-HBSS),輕揉腹部吸出腹腔液體 (內(nèi)含腹腔細(xì)胞 ),反復(fù)抽吸幾次。3、1500r/min離心 8min, 洗細(xì)胞 2 次。.精品文檔4、將腹腔細(xì)胞用含10 小牛血清的 RPMI-1640液(10 NBS-RPMI-1640)配成 2 106/ml, 加到 24 孔平底培養(yǎng)板 ,1ml/ 孔 ,置 5 CO2,37 溫箱孵育 2h 。5、每孔用 5 NBS-

5、HBSS 洗 3 次,棄去未粘附細(xì)胞 ,貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞單層。6、將 LPS(10 g/ml) 加入巨噬細(xì)胞單層 ,每孔 1ml, 培養(yǎng) 4h ；加入 10 NBS-1640?1ml 繼續(xù)培養(yǎng)至 48h, 收集上清液 ,置-20 冰箱保存 ,待測(cè) IL-1 活性及含量。（二） L929 細(xì)胞增殖 MTT 比色法MTT 比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑鹽3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-?2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下,被還原成蘭黑色的MTT- 甲 ,形成 MTT- 甲的量與細(xì)胞增殖程度呈正

6、相關(guān)。 ?故通過測(cè)定細(xì)胞形成MTT- 甲 量,可間接定量分析細(xì)胞的增殖情況 ,具體步驟如下 :1、將生長(zhǎng)成單層的L929 細(xì)胞用 0.25 胰酶消化 2 3min 。除去消化液后 ,用10% FCS 的 RPMI-1640將 L929 細(xì)胞配成 1 105/ml, 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 ,每孔 100 l。2、取 100 l 不同稀釋度的 IL-1 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品 ,分別加入各孔中 ,每孔設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔 ?,置 37 ,5% CO2 溫箱孵育 56h 。.精品文檔3、用 PBS 溶解 MTT 為 5mg/ml,用 0.22 m 膜濾器除菌及雜質(zhì)。4、上述培養(yǎng)體系取出后 ,每孔加入 10

7、l MTT(5mg/ml),37繼續(xù)培養(yǎng) 4h 。5、從每孔吸出 100 l 上清棄去 ,加酸化異丙醇或加DMSO 100 l/ 孔,?充分混勻以溶解底物。酸性條件使培養(yǎng)液中酚紅指示劑變?yōu)辄S色,以利于對(duì) MTT- 甲 轉(zhuǎn)化物的測(cè)定。6、將微量測(cè)定板置室溫?cái)?shù)分鐘,保證轉(zhuǎn)變的底物結(jié)晶被溶解。7、用酶標(biāo)光度計(jì)以檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm, 參考波長(zhǎng)為 630nm分別測(cè)量 OD 值。測(cè)定應(yīng)在酸化異丙醇加入后1h 內(nèi)完成。OD570nm OD 630nm, 再減去培養(yǎng)液對(duì)照的 OD 值。8、用 IL-1 標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度IL-1 含量 (X) 和各稀釋度對(duì)應(yīng)的OD 值(Y)作直線回歸 ,按上述概率單位分析法計(jì)算

8、待測(cè)樣品IL-2 的活性單位 (u/ml) 。（三）注意事項(xiàng)1、IL-1 誘生劑的濃度 ,培養(yǎng)條件和細(xì)胞濃度對(duì)結(jié)果均有明顯影響,?應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。.精品文檔2、培養(yǎng)器皿和研磨條件：24 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞活率較高,但生長(zhǎng)稍慢。玻璃瓶培養(yǎng)有時(shí)會(huì)因玻璃質(zhì)量和清洗不凈引起細(xì)胞死亡,故應(yīng)注意采取相應(yīng)措施。?大量培養(yǎng)時(shí)用大容量瓶比較方便,可減少操作中的污染。研磨組織可用玻璃勻漿器、不銹鋼網(wǎng)。二、 TNF 的檢測(cè) (免疫學(xué)測(cè)定法 ,雙抗體 ELISA 夾心法 )（一）原理 選用兩種針對(duì) rHuTNF- 分子不同表位的單克隆抗體 ,一種單克隆抗體作為包被抗體 ,另一種單克隆抗體作為酶標(biāo)抗體,如

9、果待測(cè)樣品中含有TNF- ,則形成抗體 -TNF- - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物 ,通過酶催化底物顯色 ,亦可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,?從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中TNF- 的含量。（二）材料和試劑1、包被抗體 : 使用時(shí)用包被緩沖液作適當(dāng)稀釋。2、酶標(biāo)抗體 : 使用時(shí)用稀釋液作適當(dāng)稀釋。3、標(biāo)準(zhǔn)品 : rHuTNF- (10ng/ml),使用時(shí)用稀釋液作倍比稀釋。4、陰性對(duì)照液 (未免疫鼠 Ig) 。.精品文檔5、ABTS 底物 :2,2-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline 6-sulfonic acid)?,?2,2-連氮基 - 雙(3- 乙基苯并噻吡咯呆 -6

10、磺酸 )。6、96 孔 ELISA 板。7、0.15mol/L,pH7.4 PBS:配其它液體用。8、包被緩沖液 : 0.05mol/L,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3緩沖液。9、洗滌液 : 0.05 Tween 20-PBS 。10 、稀釋液 :4 PEG-洗滌液 (用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)抗體)。11 、底物緩沖液 :0.1mol/L,pH5.0檸檬酸 - 磷酸氫二鈉緩沖液。12 、3H2O2 。13 、血清、枸緣酸鹽或EDTA 抗酸血漿、其它體液及細(xì)胞培養(yǎng)上清均可檢測(cè),?后者應(yīng)作適當(dāng)稀釋。14 、ELISA 讀數(shù)儀等。.精品文檔（三）操作步驟1、包被將稀釋好的包被抗體加入ELISA

11、板 ,100 l/ 孔,4放置 24h 或 48h 。2、加待檢標(biāo)本洗滌液沖洗ELISA 板 3 次,加待測(cè)樣品、陰性對(duì)照及倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品 ,100 l/ 孔 ,37 ,1h. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法 :取標(biāo)準(zhǔn)品 150 l(10ng/ml)倍比稀釋 7個(gè)濃度 :5ng/ml 、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、 156pg/ml和78pg/ml。3、加酶標(biāo)抗體 :洗板 3 次 ,加入稀釋好的酶標(biāo)抗體 ,100 l/ 孔 ,37 ,1h 。4、顯色 :洗板 3 次 ,加入配好的 ABTS 顯色液 ,100 l/ 孔,室溫或 37 顯色 15 30min 。5、

12、ELISA 讀數(shù)儀測(cè) 410nm 處 OD 值 ,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6、從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品中的TNF- 含量。四、注意事項(xiàng).精品文檔1、血清或血漿中殘存凝塊或紅細(xì)胞須經(jīng)離心去除,勿用溶血或脂肪過多的血清。2、標(biāo)本在 2 8 可儲(chǔ)存 3 天,超過 3 天應(yīng)放入 -20 或 -70 ,避免反復(fù)凍融 .3、分別用加樣器頭吸取各份標(biāo)本,避免相互交叉。4、疊氮鈉 (NaN3) 對(duì)辣根過氧化物酶 (HRP) 有滅活作用 ,在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中應(yīng)避免使用。5、底物顯色液必須臨用時(shí)配制,雙氧水應(yīng)放置在2 8,保存 6 個(gè)月以內(nèi)。附 : 試劑配制0.15mol/L,pH7.4 PBSKH2PO4 0.2gNa2HPO

13、4 12H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g.精品文檔雙蒸水加至100ml包被緩沖液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g雙蒸水加至1000ml洗滌液PBS 1000mlTween 20 0.5ml稀釋液洗滌液 100ml雞蛋清0.6ml.精品文檔PEG (聚乙二醇 ,MW6000) 2.0gNaCl 2.9g底物緩沖液Na2HPO4 12H2O 1.79g擰檬酸1.29g雙蒸水加至100ml6. ABS 顯色液ABTS 5mg底物緩沖液10ml3H2O2 20 l三、 IL-2 的檢測(cè) (基因的檢測(cè) ).精品文檔細(xì)胞因子基因的檢測(cè)包括對(duì)其DNA 的檢測(cè)和 mRNA 表

14、達(dá)的檢測(cè) ,常用的方法有Southern印跡 ,斑點(diǎn)印跡 ,PCR,原位雜交及原位 PCR 等,Northern印跡及RT-PCR。本文介紹 IL-2mRNA的測(cè)定 (斑點(diǎn)雜交法 )。將 RNA 變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上 ,可用手工操作點(diǎn)樣 ,?也可用斑點(diǎn)式點(diǎn)樣器點(diǎn)樣,再與特異性探針進(jìn)行雜交。 ?本法可用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及半定量分析。由于其操作比 Northern印跡簡(jiǎn)單、迅速 ,所需樣品量少 ,且可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè) ,故很適合于臨床應(yīng)用。 亦可用于 DNA 的檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的分子量。（一）主要試劑1. RNA 提取試劑 :TRIZO

15、L 試劑 (Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)質(zhì)粒提取試劑盒 :(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117)DNA 片段提取試劑盒 :(La Jolla)地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒 :(Boerhinger Mannheim,No.1093657)IL-2 DNA 探針.精品文檔其他試劑1) STE 溶液 0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)2) 溶液 50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10mmol/L E

16、DTA(pH 8.0)可配 100ml, 高壓滅菌 15min, 貯存于 43) 溶液 0.2mol/L NaOH( 臨用前用 10mol/L 貯存液稀釋 )1%SDS ( 配 20% 貯存液 )蓋緊瓶蓋 ,顛倒離心瓶數(shù)次 ,以充分混勻內(nèi)容物 .于室溫放置 5 10min.精品文檔4) 溶液 5mol/L 乙酸鉀 60ml冰乙酸11.5ml水 28.5ml所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L , 對(duì)乙酸根是 5mol/L（ 5) 含相應(yīng)抗生素的LB 培養(yǎng)基（ 6) 氯霉素 (0.25g/2ml)-終濃度 170 g/ml7) 溶菌酶 (10mg/ml, 溶于 10mmol/L Tris.Cl pH8

17、.0) 1ml8) 無水乙醇 (部分 -20 預(yù)冷 ).異丙醇 .75% 乙醇 (部分 4 預(yù)冷 )9) TE 緩沖液 (pH8.0)10)5mol/L LiCl 1.5ml11)RNA 酶,RPMI-1640, 胎牛血清 (FCS),ConA( 刀豆蛋白 A)等.精品文檔12)500 l 含 13%(W/V) 聚乙二醇 (PEG 800) 的 1.6mol/L NaCl13 ）3mol/L NaAc 、飽和酚、氯仿 :異戊醇 (24:1)（二）主要儀器CO2 培養(yǎng)箱 :美國 Forma Scientific產(chǎn)品 ;無菌操作臺(tái) :蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品 ;圖象處理分析儀 :同濟(jì)醫(yī)大太陽公司產(chǎn)品

18、;低溫高速離心機(jī) :上海離心機(jī)械研究所 .（三） IL-2 質(zhì)粒 DNA 探針的大量制備1、含 IL-2 質(zhì)粒 DNA 探針的提取取含 IL-2 質(zhì)粒 DNA 的單個(gè)菌落置兩個(gè)25ml LB 培養(yǎng)基 (含 100 g/ml Amp)37 220r/min振搖過夜 (約 16h).精品文檔取 10ml 菌液加 200ml LB 培養(yǎng)液 (含 100 g/ml Amp)37 150r/min振搖 4h加氯霉素 (終濃度 170 g/ml)37 220r/min振搖 3h菌液倒入 300ml 離心管中離心4 5000r/min10min離心棄上清除去殘液 (吸水紙無菌 )每管加 40ml STE 溶

19、液 (冰預(yù)冷 )懸浮細(xì)菌后 ,用移液管轉(zhuǎn)入到 50ml 離心管中4 5000r 15min 離心棄上清 ,加 5ml 溶液 (冰預(yù)冷 )懸浮細(xì)菌 ,加 1ml 新配制 (pH8.0) 的溶菌酶(10mg/ml)輕搖,室溫靜置 5min加 10ml 溶液 ,蓋上蓋子 ,將離心管小心顛倒數(shù)次混勻液體,不要用旋渦振蕩器.精品文檔冰浴10min, 且勿搖動(dòng)加 7.5ml 溶液 (冰預(yù)冷 ),輕振蕩離心管數(shù)次使之混合冰浴20 30min, 使沉淀完全 ,4 12000r/min20min離心取上清到另一 50ml 離心管中 ,加 0.6 體積異丙醇 ,混勻 ,室溫靜置 15min室溫 5000r/min

20、15min 離心棄上清用 75% 乙醇洗滌沉淀一次 (不將沉淀懸浮 ),倒出乙醇 ,倒置吸水紙上 ,使乙醇揮發(fā)用 1.5mlTE(pH8.0) 將沉淀溶解 ,加等體積冰預(yù)冷的 5M LiCl, 混勻后置冰浴10min4 12000r/min10min 離心取上清至新 EP 管, 加等體積的異丙醇 (約 3ml), 充分混勻 ,室溫靜置 15min室溫 12000rmin10min離心 (回收沉淀的核酸 ).精品文檔小心去上清 ,將管倒置以使最后殘留的液滴流盡,用 75% 乙醇洗滌沉淀 ,流盡乙醇 ,?用吸紙吸去附于管壁的液滴,將管倒置在紙巾上數(shù)分鐘,以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)用 500 l T

21、E(pH8.0) 溶解 DNA 沉淀 ,移至新 EP 管中 ,加入 RNA 酶 (終濃度 100 g/ml)37 水浴 30min加等體積 (500 l)含 13%(W/V)PEG(800)的 1.6mol/L NaCl,充分混合4 12000r/min5min 離心吸去上清 ,用 400 l TE(pH8.0) 溶解質(zhì)粒 DNA 沉淀加等體積飽和酚 (400 l)混合12000r/min10min 離心吸上層水相移至另一EP 管 ,加入等體積酚 :氯仿 :異戊醇 (25:24:1) 劇烈混勻呈乳白狀.精品文檔12000r/min10min 離心吸上層水相移至另一EP 管 ,加等體積氯仿 :異

22、戊醇 (24:1) 混勻12000r/min10min 離心吸上層水相移至新EP 管(硅化 ),加入 0.1 體積的 3mol/L NaAc(pH5.2)和 2 體積的 -20 預(yù)冷的無水乙醇 ,混勻 (可見沉淀出現(xiàn) ),置-20 2h 或 0 20min4 12000r/min15min 離心棄上清 ,加 75% 乙醇 (4預(yù)冷 )200 l,稍加振蕩 ,離心洗滌 2 次4 12000r/min5min 離心去上清敞開管口 ,將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡溶沉淀于 11 l TE 溶液中取 1 l 電泳 其余進(jìn)行酶切.精品文檔2.、經(jīng) 0.7 瓊脂凝膠電泳 ,確定有質(zhì)粒 DN

23、A 后,用 XhoI 進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系 :質(zhì)粒 DNA 10 lXhoI 6 l10*Buffer(H) 6lDW 38 l-總體積60 l 37 消化過夜3. 用 WizardTMPCR純化試劑盒回收IL-2 DNA片段1)將 60 l 酶切反應(yīng)體系經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳2)紫外燈下切下IL-2 DNA片段 ,挑出凝膠到 EP 管中 ,加 1mlResin使凝膠溶化.精品文檔3)用 5ml 一次性注射器將Resin/DNA mix轉(zhuǎn)移到 WizardTM Minicolumn中,用 2ml80% 異丙醇洗滌 Minicolum,12000g離心 20s, 加 50 lDW 到Minic

24、olumn中,12000g離心 20s,?收集 DNA 。（四）用 DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒對(duì)IL-2 探針進(jìn)行地高辛標(biāo)記?地高辛是一種僅存在于洋地黃類物質(zhì)花葉中的類固醇半抗原,又稱異羥基洋地黃毒甙配基,地高辛精可以通過一個(gè)11 個(gè)碳原子的連接臂與尿嘧啶核苷酸嘧啶環(huán)上的第5?組碳原子相連接形成地高辛精標(biāo)記的尿嘧啶核苷酸,Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精標(biāo)記核苷酸有?dig-?UTP,dig-dUTP, 和 dig-ddUTP, 它們分別適用于RNA 探針 ,DNA 探針和寡核苷酸探針的標(biāo)記。地高辛精標(biāo)記核苷酸主要通過酶反應(yīng)標(biāo)記核酸探針 ,用標(biāo)記探針做原位雜交 ,雜交體用特

25、異性抗地高辛精抗體通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)。在適宜的標(biāo)記反應(yīng)條件下,一般每 20 25?個(gè)核苷酸中帶有一個(gè)標(biāo)記的核苷酸。 這一標(biāo)記密度最利于半抗原與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛精之間的反應(yīng)。因?yàn)橐粋€(gè)標(biāo)記抗體大約復(fù)蓋20 個(gè)核苷酸。Boehringer Mannheim?公司生產(chǎn)的地高辛精DNA? 標(biāo)記試劑盒和地高辛檢測(cè)試劑盒在分子雜交中的應(yīng)用愈來愈廣泛?，F(xiàn)介紹地高辛標(biāo)記cDNA 探針隨機(jī)引物延伸法。1.、將 DNA(1 g 3 g) 加熱 95 (或 100 ) 10min, 隨即在冰 /NaCl 中驟冷。DNA 充分變性對(duì)探針標(biāo)記十分重要。5 l 對(duì)照 DNA 作為對(duì)照。.精品文檔2、將離心管置于冰

26、上 ,按順序加入下列試劑 : 1g 3 g 新鮮變性 DNA; 2l?六聚核苷混合物 (試劑 5); 2l dNTP 混合物 (試劑 6), 加入蒸餾水使總體積達(dá)到19 l,?再加入 1 l Klenow聚合酶。3、離心片刻后 ,將離心管置 37 恒溫箱內(nèi)孵育60min 。延長(zhǎng)孵育時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)20h,可使標(biāo)記量增加。4、加入 2l 0.2mol/L EDTA (pH8.0 )終止酶反應(yīng)。5、加入 2.5 l 4mol/L LiCl和 75 l 預(yù)冷 (-20 )的乙醇 ,混勻置 -70 30 min或?-202h, 使標(biāo)記探針沉淀。6、離心 (16500r/min),棄上清液 ,用 50 l 7

27、0 冷乙醇輕洗沉淀物。7、將沉淀物置于真空干燥儀內(nèi)干燥后,溶解于 50 l TE 緩沖液 ,-20 冰箱保存。（五）培養(yǎng)細(xì)胞RNA 的提取 (采用 Trizol 試劑盒提取 RNA)1、收集培養(yǎng)細(xì)胞 ,用 RPMI-1640培養(yǎng)液離心洗滌3 次,第二次離心洗滌時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5106 1107 細(xì)胞。.精品文檔2、最后一次洗滌時(shí)吸1ml 細(xì)胞懸液至 1.5mlEP 管中 ,在臺(tái)式離心機(jī)離心 ,棄上清 ,加入 1mlTRIZOL 試劑 ,用移液器輕輕吹打細(xì)胞數(shù)次,充分混勻 ,室溫 (15 30 )靜置 5min 后 ,加入 0.2ml 氯仿 ,快速搖動(dòng) 15s, 室溫靜置

28、 2 3min 。3、于 28 離心 14600r/min15min, 上層無色水相 (RNA 溶于此層中 )?約占整個(gè)細(xì)胞勻漿液的60 。4、小心吸取其中400 移至另一 Eppendorf管中 ,加入 0.5ml 異丙醇 ,輕柔混勻 ,?室溫靜置 510min 后。5、于 28 離心 14600r min 10min, 在管壁下底處可見一乳白色小沉淀塊,即為 RNA 。棄上清。用冰冷的 75 乙醇 1ml 洗 RNA 沉淀 (不用吹打沉淀 ),然后于 2 8,11500r/min離心 5min, 去除上層乙醇后于無菌環(huán)境(或真空 )風(fēng)干 RNA 沉淀 ,但不要使沉淀過于干燥 ,以免影響 R

29、NA 的溶解 ,用 20 l DEPC 處理的雙蒸水溶解RNA 沉淀。置 -80 冰箱備用。（六） RNA 的斑點(diǎn)雜交1、RNA 變性： 20 l RNA溶液（ 2g RNA ）.精品文檔4l 20 SSC14 l 37%甲醛 （formaldehyde）40 l 100% 甲酰胺-60 溫育 30min, 水浴冷卻樣品在上述 RNA 液體中每 100 l 液中加 210 l 20 SSC(共 310 l),每孔加 150 l。2、纖維素膜處理過程： 硝酸纖維素膜（0.45 m ）水中浸泡 min, 再用 20 SSC?室溫浸泡 h 。3、濾器的處理及點(diǎn)樣：用0.1N NaOH浸泡（洗）多孔過

30、濾加樣器 ,?再用滅菌水徹底沖液。將纖維素膜壓在多孔加樣器的上層板的上面,再壓在下層板上 ,趕去氣泡 ,?然后兩部分夾緊 ,點(diǎn)樣前 ,先用 20 SSC（200 l）洗一遍每個(gè)孔 ,真空抽吸干凈后 ,再分別點(diǎn)樣。如有未點(diǎn)樣孔須用 150 l 的 20 SSC 封住其孔 ,然后用真空泵抽吸干凈 ,再用 20 SSC 清洗一次 ,待流體濾過纖維膜后 ,繼續(xù)抽吸 min 以干燥濾膜。.精品文檔4、取出膜 ,80 烤 2 3h, 膜保存于 -20 配 20 SSC 標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽 pH 7.0NaCl 175.3gNa.Citrat 88.2g（檸檬酸鈉）H2O至 1000ml用 10N NaOH or

31、 10N HCl調(diào) pH 至 7.0, 高壓消毒1N NaOH約 0.5ml5、雜交預(yù)雜交1)預(yù)雜交液： 5 SSC, 0.75%(W/V) 封閉劑 , 0.1%(W/V)N-lauroylsarcodine,?0.02%(W/V) SDS2)先將預(yù)雜交液熱至60 。.精品文檔3)將帶有目的 RNA 的硝酸纖維素膜放入稍寬于濾膜的塑料袋,?加入預(yù)雜交液 ?,?按每 100cm2濾膜加 20ml 。4)盡可能除凈袋中的空氣,用熱封口器封住袋口 ,將其置 60 水浴過夜 ,?其間不斷翻動(dòng)塑料袋。雜交1)雜交液 (DIG Easy Hyb(20ml/100cm2)預(yù)溫輕振蕩 30min2)將標(biāo)記探針 DNA(5 25ng/ml)煮沸變性 5min, 迅速置冰水中冷卻 ,3)加入到預(yù)溫的DIG Easy Hyb(2.5ml/100cm2)中混合 ,避免形成汽泡4)然后每張膜上注入預(yù)雜交液和滴加探針/DIG Easy Hyb5)振蕩孵育至少6h, 在微量 DNA 時(shí),建議 16h, 使其雜交。6)2 SSC,0.1SDS 清洗 2 次,每次 5min, 室溫。7)68 振蕩條件下 ,0.1 SSC, 0.1 SDS 清洗 2 次 ,每次 15min 。.精品文檔（七）免疫測(cè)定1、雜交后徹底清洗 ,將膜置入清洗緩沖液中1 5min 。2.、 100ml 封閉緩沖液 (