1、RNAi的實驗設(shè)計及使用步驟RNA干擾(RNAinterfering,RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。細(xì)胞中的核糖核酸酶III家族成員之一的,dsRNA特異性的核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21-25個核苷酸組成的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，隨后siRNA作為介導(dǎo)子引起特異性地降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。B.RNAi實驗流程SiRNA的轉(zhuǎn)染(siRNATransFBction)功能研兗(F

2、uridaonResearch)RNAi結(jié)果檢測MeasureKnockdcvm)址基因確認(rèn)(TargerGneIdentrfltBtion)siRNA設(shè)計CsiRNADesign)siRNA的制客(siRNAGeneratiDn)siRNA設(shè)計A.哺乳動物siRNA設(shè)計基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇。目的序列可以隨機(jī)選擇也可以通過在目的基因的不同區(qū)域上測試不同的序列以決定何種序列是最有效的。哺乳動物siRNA設(shè)計需要注意的幾個方面1從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找,AA”二連序列，并記下其3端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這

3、19個堿基(不包括AA重復(fù))來設(shè)計。2避免在起始密碼子或無義區(qū)域附近選擇目的序列。3.siRNA序列的GC含量應(yīng)為30%-60%左右。4在設(shè)計siRNA時不要針對5和3端的非編碼區(qū)(untranslatedregions,UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。5將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性。將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（/BLAST

4、/）。7.選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。8.陰性對照:一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣需要檢查它和其他基因是否具有同源性。9.有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別，因為這個突出端無需和靶序列互補(bǔ)。合成siRNA時可直接提供以AA打頭的21個堿基序列。siRNA轉(zhuǎn)染的方法哺乳動物轉(zhuǎn)染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE葡聚糖和polybrene

5、、機(jī)械法（例如，顯微注射和基因槍）陽離子脂質(zhì)體試劑，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法（具體轉(zhuǎn)染方法可參考InvitrogenLipofectamine2000）。貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序以24孔板為例，若要檢測基因沉默或者過表達(dá)效果，推薦最低RNAoligo終濃度為50nM（不同細(xì)胞可以上下優(yōu)化2-4倍濃度）；遵循以下操作方法可以高效地將RNAoligo轉(zhuǎn)染貼壁和懸浮培養(yǎng)的多種真核細(xì)胞。但是對某些特殊的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件，或特殊應(yīng)用等，也需要單獨特別優(yōu)化。1.細(xì)胞鋪板轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度：一般來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率。然而，不同細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)染密度都不盡相

6、同。因此在初次轉(zhuǎn)染某種細(xì)胞時，可以通過預(yù)實驗先確認(rèn)該細(xì)胞最佳的狀態(tài)及轉(zhuǎn)染密度。2.復(fù)合物的制備及轉(zhuǎn)染1）使用前將GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑放置于室溫中，使用前輕輕混勻；2）在1.5ml無菌離心管中加入50卩1無血清培養(yǎng)基或OPTI-MEM，并添加適量的轉(zhuǎn)染試劑，用移液器輕輕混勻，室溫靜置5min；3）同時在另一1.5ml無菌離心管中加入50卩1無血清培養(yǎng)基或OPTI-MEM，并添加適量的RNAoligo/DNA（參見表2），用移液器輕輕混勻，室溫靜置5min。4）將GP-transfect-Mate-培養(yǎng)基混合物滴加至RNAoligo/DNA-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻，

7、室溫靜置15-20min后，立即轉(zhuǎn)染。注：復(fù)合物盡量在60min內(nèi)使用，并且GP-transfect-Mate-培養(yǎng)基混合物和RNAoligo/DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。3轉(zhuǎn)染過程1）趁靜置時，給24孑L板換液，每孔換上400pl預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基；2）將100pl轉(zhuǎn)染混合物加入孔中/終體系為500plo加完后將板輕輕晃動以使復(fù)合物均勻分布；3）37C靜置培養(yǎng)細(xì)胞，4-6h換成完全培養(yǎng)基。24-72h檢測mRNA表達(dá)，48-96h檢測蛋白表達(dá)。13操作流程（24孔板）以24孔板為例，若要檢測基因沉默的效果，推薦最低siRNA終濃度10nM:若要在顯微鏡下從熒光強(qiáng)度看轉(zhuǎn)染效

8、率，因熒光信號被檢測到需要一定的敏感度，推薦siRNA終濃度50nM。遵循以下操作方法可以高效地將siRNA轉(zhuǎn)染貼壁和懸浮培養(yǎng)的多種真核細(xì)胞。A細(xì)胞鋪板貼壁細(xì)胞數(shù)量：在轉(zhuǎn)染實驗之前的18-24個小時，在每個孔的500pl生長培養(yǎng)基中加入1.5-3.5x104個細(xì)胞（確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度在30-50%）。懸浮細(xì)胞數(shù)量：轉(zhuǎn)染實驗的當(dāng)天，在500pl生長培養(yǎng)基中加入1-2x105個細(xì)胞。注意：轉(zhuǎn)染時應(yīng)確保細(xì)胞沒有過度生長或處于休止期。B轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備1將siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑放置于室溫中，使用前輕輕混勻；2將100卩1OPTI-MEM或無血清培養(yǎng)基加入無菌EP管中；3在上述含有無血清培養(yǎng)基的E

9、P管中加入lOpmol（140ng）待轉(zhuǎn)染的siRNA，并充分混勻。隨后在管子中加入2卩1siRNAMate轉(zhuǎn)染試劑，快速渦旋10s使其完全混勻；4室溫靜置10分鐘，使siRNA和轉(zhuǎn)染試劑形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。靜置時間不要超過30minC.轉(zhuǎn)染過程1趁靜置時，給24孑L板換液，每孔換上0.5ml預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基；2.將靜置完畢的100卩1轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，終體系為600卩1,siRNA終濃度為16.7nM。加完后將細(xì)胞培養(yǎng)板輕晃搖勻。3.37C靜置培養(yǎng)細(xì)胞，檢測基因沉默水平可在24-72h內(nèi)收樣檢測mRNA（RT-PCR實驗等）或48-96h內(nèi)檢測蛋白（WesternB1ot實驗等）。常見問題針對

10、人體基因設(shè)計的siRNA對其他物種是否也有效？一般siRNA都具有物種特異性，很少與其他物種有相同的靶位點，所以針對人體基因設(shè)計的siRNA不會沉默其他物種的同源序列。然而，也有研究表明siRNA經(jīng)過特異性設(shè)計后能對兩個或兩個以上的物種有效，這需要仔細(xì)進(jìn)行siRNA設(shè)計和生物信息學(xué)分析。你們提供的siRNA是怎樣裝運的？如果在常溫下放置了一個星期，還有效嗎？siRNA是凍干粉包裝的，在常溫下運輸。這些凍干的樣品在室溫下能穩(wěn)定保存2-4個星期，所以放置一個星期不會影響其沉默效果。但我們建議您收到樣品后最好保存于-20C或-70C有霜冷凍箱中。在體外實驗中，需要多少量的siRNA？我們建議您用于實

11、驗的siRNA的濃度為lOOnM。lnmolsiRNA的量對于一個24孔板或是96孔板的實驗已經(jīng)足夠了。用l00nM的siRNA轉(zhuǎn)染時只得到50%沉默效率，我可以將siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎？增加siRNA的濃度一般不能改進(jìn)沉默效率。高濃度的siRNA將可能導(dǎo)致去靶作用和對細(xì)胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率來自于合理的設(shè)計，在l00nM甚至更低的濃度都可能有75%的沉默效率。另外，低的轉(zhuǎn)染效率會導(dǎo)致低的沉默效率，建議您更進(jìn)一步優(yōu)化siRNA的導(dǎo)入條件。5.24定量RNA的公式是什么？研究者可以用Beer法則定量RNA:吸光度(260nm)=(摩爾消光系數(shù))*(濃度)*

12、(路徑氏度，cm)。為了便于理解，等式變?yōu)椋簼舛榷?吸光度，260nm)/(摩爾消光系數(shù))*(路徑氏度，cm)。當(dāng)使用一個標(biāo)準(zhǔn)的10mm比色皿時，在公式中路徑氏度這個變量等于1。6卩1濃度為10uM的siRNA溶解液中含有多少腿的siRNA?首先計算含有多少nmol的siRNA:a.等式:？nmo1=(6y1)(10umo1/L)；b.單位換算：？nmol=(6卩1)(10ymo1/L)(lL/l,000,000卩1)(l,000nmo1/ymo1)；c.答案:？nmol=0.06nmol。然后利用siRNA的平均分子量(13,300g/mol)*nmol變?yōu)閜g:a.等式：？yg=(0.06

13、nmo1)(13,300g/mo1)；b.單位換算：？yg=(0.06nmo1)(13,300g/mo1)(lmo1/l,000,000,000nmo1)(1,000,000pg/g)；c.答案:?pg=0.798約0.8pg。所以6p1濃度為10pM的siRNA溶解液中含有0.8pg的siRNA。我需要濃度為20uM的樣品，如何計算重懸siRNA緩沖液的量？樣品濃度的計算如下：(siRNA的量，nmol)/(重懸體積，p1)二樣品濃度，pmo1/L。在解答前應(yīng)先統(tǒng)一單位，確保單位可以抵消。例如:您購買了20nmol的siRNA，想溶解為5OyM的樣品。可按以下方法計算重懸緩沖液體積：a.等式

14、：(20nmol)/?yl=50umol/L；b.解答未知量：？yl=(20nmol)(lL/50umol)；c.單位換算：？yl=(20nmol)(lL/50ymol)(lymol/l,000nmol)(l,000,000yl/lL)；d.答案:?m=400!il。因此，應(yīng)該使用400山緩沖液去重懸20nmol的siRNA，溶解后為50pM的樣品。一定需要陰性對照嗎？是，陰性對照是RNA干擾實驗中不可缺少的。由于在超過200nM的濃度下,siRNA有可能會導(dǎo)致非特異性的壓力反應(yīng)，在實驗體系中必需設(shè)置陰性對照。它能夠幫助我們確認(rèn)基因表達(dá)水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結(jié)果。由于siRNA

15、的合成方法和工藝以及轉(zhuǎn)染試劑等因素可能導(dǎo)致廣泛的基因沉默現(xiàn)象。如果沒有陰性對照，研究人員很可能錯誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當(dāng)作由RNAi引起的基因特異性沉默。常用的陰性對照有哪些類型？常用的陰性對照大體分為兩種，一種是使用通用陰性對照序列，該序列已經(jīng)被上千篇文章使用；另一類是使用和靶基因siRNA打亂序列的siRNA作為陰性對照，這樣的陰性對照和通用序列相比較，一方面合成是按照定制產(chǎn)品價格合成的，另一方面，由于打亂序列是沒有經(jīng)過驗證的序列，有可能會產(chǎn)生offtarget現(xiàn)象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作為陰性對照。在陰性對照體系中和實驗體系中觀察到同樣的實驗結(jié)果，這是什么

16、原因？這個結(jié)果充分說明了設(shè)置陰性對照的必要性。該結(jié)果表明您所觀察到的表型不是序列特異性knockdown產(chǎn)生的表型，您需要降低siRNA的工作濃度。為什么說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要？陽性對照作為一個實驗系統(tǒng)檢查是很重要的。也就是說，當(dāng)您看到siRNA陽性對照的預(yù)期實驗結(jié)果時，您能確保在您的實驗方法中您的轉(zhuǎn)染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。通常最好的陽性對照是內(nèi)在的對照。你們能提供預(yù)先合成的siRNA對照么？可以。提供許多預(yù)先合成的用于RNA干擾實驗的對照雙鏈。用于對照的siRNA的最佳濃度是多少？陽性對照和陰性對照的siRNA的濃度都應(yīng)該與基因特異性的siRNA的濃度相同。在siRN

17、A上進(jìn)行標(biāo)記的最佳位點在哪里？反義鏈的5端標(biāo)記會影響siRNA的沉默活性，所以不推薦標(biāo)記這個位點。在其他三個末端進(jìn)行標(biāo)記對沉默活性幾乎沒有影響。有研究表明正義鏈的5端標(biāo)記是最有效的化學(xué)合成位點。熒光標(biāo)記的siRNA是不是可以作為良好的對照？如何檢測熒光標(biāo)記的siRNA?已經(jīng)有為數(shù)不少的實驗室研究過熒光標(biāo)記的siRNA的熒光檢測結(jié)果和knockdown效率之間的正相關(guān)關(guān)系。熒光標(biāo)記雙鏈?zhǔn)亲畛Ｓ玫膬?yōu)化轉(zhuǎn)染條件的方法?？梢杂昧魇郊?xì)胞儀或者熒光共聚焦顯微鏡檢測標(biāo)記的siRNA。FAM的最大吸收率和収射率各在哪個波段？FAM在495nm處有最大吸收率，在520nm處有最大發(fā)射率。如何篩選轉(zhuǎn)染試劑？好的轉(zhuǎn)

18、染試劑有以下特點：1.對siRNA有較高的轉(zhuǎn)染率；2.對細(xì)胞的毒性小。在mRNA水平檢測siRNA導(dǎo)入的效果比用看家基因的siRNA陽性對照檢測更為準(zhǔn)確。轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，我應(yīng)該如何處理？如果出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，意味著您的轉(zhuǎn)染條件仍然需要優(yōu)化：轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化一般包括以下幾個方面：1.調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑的濃度；2.在轉(zhuǎn)染后適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)更換無轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液；3.調(diào)整細(xì)胞的生長狀態(tài)：一般處于良好生長狀態(tài)的細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑就有更好的耐受性；4.調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的比例：如果同一管轉(zhuǎn)染試劑在不同實驗中對細(xì)胞的毒性有差異，一般說來應(yīng)該是實驗過程本身帶來的差異：如果已經(jīng)做了以上幾項工作，轉(zhuǎn)染效率仍然

19、得不到提高，建議您更換一種轉(zhuǎn)染試劑。如何將siRNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)？使用什么樣的轉(zhuǎn)染方法，很大程度上取決于您使用的細(xì)胞系：1.貼壁的、易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們推薦使用Lipofectamin2000或siRNAMate轉(zhuǎn)染試劑。2.懸浮的或原代的細(xì)胞，我們推薦使用電擊轉(zhuǎn)化方法；3.電擊轉(zhuǎn)化效率仍然很低的細(xì)胞，需要選擇載體系統(tǒng)。吉瑪基因除提供化學(xué)合成的siRNA以外，還提供完整的載體系統(tǒng)。我的課題主要是研究細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，我手上有一些新基因需要使用RNA干擾進(jìn)行深入研究，我該如何選擇對照系統(tǒng)？用RNAi進(jìn)行pathway研究，是RNAi主要應(yīng)用之一。在這樣的課題中，對照系統(tǒng)的選擇尤其重要。已經(jīng)發(fā)表的和

20、已經(jīng)驗證的siRNA為RNA干擾研究提供了系統(tǒng)性對照。用RNAi進(jìn)行細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的研究，以往已經(jīng)有眾多的文獻(xiàn)。我剛剛開始接觸RNA干擾技術(shù)，從文獻(xiàn)上看，不同細(xì)胞應(yīng)該選用不同的轉(zhuǎn)染試劑，不同的研究目的，應(yīng)該使用不同的siRNA，我的經(jīng)費有限，如何有效確定我的研究體系？在開始RNA干擾研究之初，需要確定以下幾個方面：使用化學(xué)合成的siRNA還是使用載體構(gòu)建shRNA?我們推薦您使用化學(xué)合成的方法來篩選有效的目的片段，然后把您篩選出來的目的片段插入到載體，進(jìn)行抗性篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，再做長期研究。反義核酸和RNAi有何差異？反義核酸和RNAi從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做

21、一個簡單的介紹：從原理上說，反義核酸是一段與靶基因配對的單鏈DNA或類似DNA的片段與靶基因結(jié)合，結(jié)果阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄或是翻譯，以往的研究表明在反義核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關(guān)性，這就在一定程度上限制了反義核酸的應(yīng)用。RNAi的作用機(jī)理是雙鏈的RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以選擇在高度特異針對靶基因的位置，也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術(shù)問世以來，國外很多專業(yè)從事反義核酸研究的公司都紛紛轉(zhuǎn)向RNAi研究，ISIS是一個非常就有代表性的例子。他們認(rèn)為，如果使用反義核酸可以進(jìn)行的研究，以及反義

22、核酸可以涉及的研究領(lǐng)域，RNAi均可以毫不示弱的開展，并且應(yīng)該會得到更加令人滿意的結(jié)果。我使用合成的雙鏈DNA克隆載體，但是測序結(jié)果不正確，是DNA合成的問題，還是其他問題？首先，質(zhì)量良好的、并且是退火狀態(tài)良好的dsDNA是克隆成功的關(guān)鍵因素。一般情況下，需要挑不止一個克隆測序（通常是2個以上），如果兩個克隆的序列都是錯誤的，并且錯誤的堿基是相同的，那基本可以確定是DNAoligo合成的問題.如果兩個克隆的不同堿基發(fā)生錯誤，有可能是合成片段本身的問題，也有可能是克隆過程造成的問題，可以再多挑1-2個克隆測序確證。大多數(shù)情況下，兩個陽性克隆中，一般至少會有一個克隆是正確的，這種個別堿基在個別分子

23、中的錯誤是合成和克隆過程共同造成的，但一般發(fā)生的幾率較低。我計劃使用RT-PCR檢測基因knockdown結(jié)果，之前應(yīng)該注意哪些問題？我們推薦RT-PCR的引物應(yīng)該設(shè)計在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導(dǎo)的基因knockdown機(jī)制是RSIC先介導(dǎo)靶mRNA的切割，切割導(dǎo)致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時間點，因此，設(shè)計于同側(cè)的PCR引物可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。另外，RT-PCR結(jié)果會因為靶基因mRNA降解時間不同、細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA豐度不同而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，特別對于豐度較高的基因，推薦使用的檢測方式包括量PCR、Northern檢測、Western檢測等。這些方法會更加真實的反映RNAi的結(jié)果。開始體內(nèi)實驗前需要注意什么問題？體內(nèi)實驗設(shè)計包含動物模型的選擇、給藥途徑、劑量和給藥次數(shù)等等。siRNA使用的數(shù)量及濃度主要取決于給藥靶點的性質(zhì)，諸如腫瘤的類型，組織的類型，靶基因表達(dá)水平，動物模型個體大小等等，針對不