1、總SOD活性檢測試劑盒（WST法）產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝S0102總SOD活性檢測試劑盒（WST法）100次產(chǎn)品簡介：碧云天的總SOD活性檢測試劑盒（WST法）（TotalSuperoxideDismutaseAssayKitwithWST-1）是一種基于WST-1的顯色反應(yīng)，通過比色來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中OD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。超氧化物岐化酶（SuperoxideDismutase,SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫H22）和氧氣（。2），是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。目前有多種SOD活性測定法，其中NBT（氮藍(lán)四唑）法由于使用方便而被廣泛使用。但NBT法產(chǎn)生

2、的甲臜染料水溶性差，易和被還原的黃嘌吟氧化酶相互作用，抑制百分率達(dá)不到100%等，從而使檢測的靈敏度和精確度受到影響；細(xì)胞色素C法也是一種常用來檢測SOD活性的方法，但細(xì)胞色素C其氧化活性高，易受樣品中的還原劑干擾，另外該方法需要連續(xù)測定吸光度值，對于SOD的檢測靈敏度比較低，并且不太適合大批量樣本的檢測。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中最先進(jìn)的WST-1法。WST-1即2-（4-Iodophenyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2,4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium,monosodiumsalt。參考下圖，WST-1可以和黃嘌吟氧化酶催化產(chǎn)生的超

3、氧化物陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲臜染料（formazandye），該反應(yīng)步驟可以被SOD所抑制。通過對WST-1產(chǎn)物的比色分析即可計(jì)算SOD的酶活力。xanthineWSTdformazanh2o2yF八JWSTduricacid1中口1基于黃嘌吟氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系和WST-1的SOD酶活力檢測原理圖。XO：xanthineoxidase。WST-1本身吸光度很低，且反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物，提高了SOD檢測的靈敏度和特異性，適合高通量篩選研究。同時(shí)WST法測定SOD酶活力時(shí)，最大抑制百分率達(dá)到100%,并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾，使檢測效果顯著提高。本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織裂的裂

4、解液或勻漿液、全血、紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物、血清等生物樣品中的SOD活性。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測。包裝清單：產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝S0102-1SOD檢測緩沖液20mlS0102-2WST-1100glS0102-3酶溶液50glS0102-4稀釋液10ml說明書1份保存條件：4C保存，半年有效。S0102-2WST-1溶液需避光保存。注意事項(xiàng)：待測樣-70C可保存1個(gè)月。需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致部分SOD失活?？寡趸飼Ρ驹噭┖械臋z測產(chǎn)生干擾，例如0.1mMascorbicacid，5mMGSH都會使測定出來的吸光度上升約10%。此時(shí)盡管樣品沒有顏色，如果設(shè)置了使用說明中的空白對照3，就可以消

5、除樣品中的抗氧化物的干擾。酶溶液可能會有少量沉淀，屬正?，F(xiàn)象，請混勻后使用。為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。使用說明：樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集細(xì)胞，用4CPBS或生理鹽水洗滌1-2遍。沉淀用碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)裂解，或用其他適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀?，或進(jìn)行勻漿。對于裂解液或勻漿液，4C離心取上清作為待測樣品。裂解或勻漿宜在冰浴或4C進(jìn)行操作。組織樣品的準(zhǔn)備：動(dòng)物用生理鹽水(0.9%NaCl,含有0.16mg/m1肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013咸其他適當(dāng)溶液進(jìn)行勻漿。對

6、于勻漿產(chǎn)物，4C離心取上清作為待測樣品。裂解或勻漿宜在冰浴或4C進(jìn)行操作。紅細(xì)胞或血漿樣品的準(zhǔn)備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4C600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測。紅細(xì)胞樣品可同細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備，可以用碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或其他適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀?。上述樣品?zhǔn)備完畢后可以用碧云天生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細(xì)胞或組織裂解液或勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右。每種樣品準(zhǔn)備2

7、0-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的稀釋液適當(dāng)稀釋樣品。裂解好的樣品通常至少需要加入等體積的稀釋液進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)日測定，可以冰浴保存，如果當(dāng)天不能完成測定，可以-70C凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。試劑盒的準(zhǔn)備工作：WST工作液的配制：按照每1.8毫升SOD檢測緩沖液中加入10微升WST-1的比例進(jìn)行配制(用SOD檢測緩沖液將WST-1稀釋約180倍)，混勻后即為WST-1工作液。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制適當(dāng)量的WST-1工作液，配制好的WST-1工作液4C可保存1-2個(gè)月，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。酶工作液的配制：先把試劑盒中的酶

8、溶液輕輕混勻，并輕輕離心沉淀酶溶液至管底。按照每200微升稀釋液中加入5微升酶溶液的比例進(jìn)行配制(用稀釋液將酶溶液稀釋約40倍)，混勻后即為酶工作液?？梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要配制適當(dāng)量的酶工作液，配制好的酶工作液4C可保存1-2周，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量比較少且易沉降，必須注意充分混勻。(可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：100U/ml，50U/ml,20U/ml,10U/ml，5U/ml，1U/ml，0.1U/ml，0.01U/ml，0.001U/m1。在隨后的檢測中可以各取20微升,參考樣品進(jìn)行檢測。說明：本試

9、劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。樣品測定：參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。參考下表依次加入待測樣品和其他各種溶液。加入酶工作液后充分混勻。注意：加入酶工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因?yàn)榧尤朊腹ぷ饕旱臅r(shí)間先后而導(dǎo)致的誤差。樣品(Sample)空白對照1(B1ank1)空白對照2(B1ank2)空白對照3(B1ank3)*待測樣品20卩1-20卩1稀釋液-20卩140卩140卩1WST工作液180卩1180卩1180卩1180卩1酶工作液20卩120卩1-*如果樣品有顏色或含

10、有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。37C孵育20分鐘。(說明：孵育20分鐘至30分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異)在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。4.樣品中總SOD活力的計(jì)算：抑制百分率的計(jì)算：參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率：抑制百分率=(A-A)(A-A)/(A-A)x100%空白對照1空白對照2樣品空白對照3空白對照1空白對照2如果沒有設(shè)置空白對照3，則可以把計(jì)算公式簡化為：抑制百分率=(A-A-A)/(A-A)x100%

11、空白對照1空白對照2樣品空白對照1空白對照2如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣品。SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌吟氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換SOD酶活力的計(jì)算:參考上圖A和B,SOD酶活力和抑制百分率呈非線性關(guān)系，而1/SOD酶活力和1/抑制百

12、分率成線性關(guān)系。上圖僅作參考，不同的樣品不同的檢測條件，實(shí)際測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能和上圖有較明顯的差別。SOD酶活力的計(jì)算公式如下：待測樣品中SOD酶活力單位二檢測體系中SOD酶活力單位二抑制百分率/（1抑制百分率）units例如，當(dāng)抑制百分率為50%時(shí)，待測樣品中SOD酶活力單位=50%/（150%）units=1unit；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí)，待測樣品中SOD酶活力單位=60%/（160%）units=1.5units。如果樣品為細(xì)胞或組織的裂解液或勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。附1：SOD酶活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測和計(jì)算。附2：SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測SO