1、川芎嗪對小鼠小細(xì)胞肺癌血管生長和VEGF表達的抑制【摘要】目的觀察川芎嗪對實體腫瘤及其血管生長的抑制作用及作用環(huán)節(jié)。方法用57bl小鼠接種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞造模,川芎嗪注射液100、200g/kg/d腹腔注射,21d后檢測腫瘤體積、重量及微血管密度,并用esternblt法和免疫組化法分析腫瘤細(xì)胞vegf的表達。結(jié)果川芎嗪能減少小鼠小細(xì)胞肺癌腫瘤體積、重量,降低腫瘤微血管密度,抑制腫瘤細(xì)胞vegf的表達。結(jié)論川芎嗪能抑制小鼠小細(xì)胞肺癌的生長,其機制可能與抑制vegf表達、降低腫瘤微血管密度有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】川芎嗪小細(xì)胞肺癌微血管密度血管內(nèi)皮生長因子惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤組織中新血管生成,抑制

2、血管生成能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移1。腫瘤細(xì)胞可以分泌多種血管生成因子,其中血管內(nèi)皮生長因子(vegf)是高效、高特異性作用于血管內(nèi)皮的促血管生成因子,與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)2。川芎是著名的活血、化瘀、抗腫瘤中藥。川芎嗪可以抑制腫瘤的生長,其機制與其促進免疫功能有關(guān)3。川芎素(阿魏酸鈉)抑制人肺癌a549細(xì)胞增殖,其機制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)4。本試驗觀察川芎嗪對小鼠小細(xì)胞肺癌的抑制作用以及對腫瘤微血管密度和vegf表達的影響,旨在討論活血化瘀中藥可能存在的其它作用及其機制。1材料與方法1.1藥品與試劑鹽酸川芎嗪注射液tp，4g/2l/支，北京市第4制藥廠,硫酸魚精蛋白注射液(pt,50g/5l/

3、支,上海生物化學(xué)制藥廠),vegf抗體和因子抗體santaruze產(chǎn)品，sab試劑盒武漢博士德生物工程，其余試劑均為市售分析純。1.2動物分組與造模5取40只1820g的57bl小鼠(購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),雌雄各半,隨機分為4組，川芎嗪1、2組、魚精蛋白組(陽性對照)、生理鹽水組(ns)。取接種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)14d的57bl荷瘤小鼠脫頸椎處死,無菌條件下取瘤組織加生理鹽水研磨成勻漿,調(diào)細(xì)胞濃度后,每只正常57bl小鼠右臀部皮下接種1107個小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。1.3實驗方法川芎嗪組劑量分別為100、200g/kg,生理鹽水組每只0.2l,接種后第2天開場用藥,每天1

4、次,腹腔注射連續(xù)21d;魚精蛋白組60g/kg,接種后第2天皮下注射1次,第3天起每12小時1次,連續(xù)20d。第22天脫頸椎處死各組小鼠進展檢測。1.4一般檢測接種前和接種后每3天稱量1次體重,按體重變化調(diào)整給藥劑量。接種后每3天用游標(biāo)卡尺測量1次荷瘤小鼠腫瘤的最長徑(a)和最小徑(b),按v=0.5ab2計算腫瘤體積,第22天處死小鼠,取接種部位腫瘤稱重,計算腫瘤生長抑制率腫瘤生長抑制率(%)=(生理鹽水組平均瘤重-治療組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重100%。1.5免疫組化染色取腫瘤組織,固定、脫水、包埋,4連續(xù)切片,vegf抗體或因子抗體為抗,陰性對照用pbs代替抗,按照試劑盒說明書進展

5、sab法免疫組織化學(xué)染色。1.6vegf表達的定量分析選取陽性細(xì)胞密集區(qū)域,在400顯微鏡下選取20個陽性細(xì)胞,用圖像分析系統(tǒng)測定平均吸光度(a值),以此代表陽性細(xì)胞胞質(zhì)單位面積內(nèi)vegf相對含量。1.7腫瘤微血管密度分級vd)根據(jù)eidner1標(biāo)準(zhǔn)對著染的血管進展密度分級。高血管密度區(qū)多位于腫瘤邊緣。在200倍鏡每0.742的視野下,以與周圍腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成清楚顯區(qū)別的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個微血管,記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù),取其平均值。1.8esternblt參照文獻6,取腫瘤組織,溶于laelis溶解緩沖液中(1%tritnx-100,1l/lpsf,21g/lartinin,

6、0.5g/lleupeptin,1%sds)，離心后將上清液移于另一試管中。lry法檢測溶解液中蛋白含量。參加2sds加樣緩沖液(125l/ltris-hl，20%甘油,0.01%溴酚藍(lán),4%sds,200l/ldtt)，置沸水浴中加熱5in,按每孔30g蛋白量加樣進展sds2聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25l/ltris，192l/l甘氨酸,20%甲醇)中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將膜浸沒于含5%脫脂奶粉的tbst液中封閉?？?、抗分別與膜孵育,顯影,nihiage1159計算機軟件分析條帶。1.9數(shù)據(jù)處理計量資料結(jié)果以xs表示,進展單因素方差分析,組間均值兩兩比擬用shk法,以上結(jié)果

7、均由統(tǒng)計軟件包(spss10.0)完成。2結(jié)果2.1川芎嗪對各組腫瘤生長體積的影響川芎嗪各劑量組、魚精蛋白組腫瘤體積均小于生理鹽水組(均p0.05),見圖1。結(jié)果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細(xì)胞肺癌實體瘤生長有抑制作用。圖1川芎嗪對各組腫瘤生長體積的影響2.2川芎嗪對腫瘤重量及生長抑制率的影響川芎嗪各個劑量組、魚精蛋白組小鼠接種部位的腫瘤重量均低于生理鹽水組(均p0.05)，見表1。實驗結(jié)果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細(xì)胞肺癌實體瘤生長有抑制作用。表1川芎嗪對腫瘤重量及腫瘤血管生長的影響注：*p0.05，*p0.01vsns2.3川芎嗪對腫瘤細(xì)胞vegf表達及腫瘤血管生長的影響圖像分析顯示:v

8、egf主要表達于腫瘤細(xì)胞內(nèi),陽性染色的腫瘤細(xì)胞多位于浸潤邊緣。血管內(nèi)皮細(xì)胞呈弱陽性染色。川芎嗪各劑量組vegf表達都呈現(xiàn)出弱陽性,各組a值與生理鹽水組比擬,差異有顯著性p0.05)，見表2。實驗結(jié)果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表達vegf有抑制作用。圖像分析顯示:腫瘤組織切片中,微血管密集區(qū)多位于腫瘤細(xì)胞浸潤的前緣部位。不同劑量的川芎嗪組腫瘤血管密度分級vd值低于生理鹽水組(均p0.05)，見表2。實驗結(jié)果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細(xì)胞肺癌實體瘤血管生成有抑制作用。表2川芎嗪對腫瘤血管生長的影響注：*p0.05，*p0.01vsns2.4esternblt3討論vegf是一種重要

9、的血管生長因子,對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、基膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管構(gòu)建的調(diào)控作用較強,且特異性高7。研究證明,vegf是腫瘤血管形成的關(guān)鍵性介質(zhì)8。無論是rna程度還是蛋白程度,在許多動物和人的惡性腫瘤中都有vegf的高表達;抑制vegf可以抑制腫瘤的生長9。本研究結(jié)果顯示,小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可表達vegf，并與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)。這與同類研究報道一致。不少研究發(fā)現(xiàn),腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能隨著腫瘤微血管密度(vd)的增加而明顯增加10。因此,vd被認(rèn)為是預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的一項重要指標(biāo)11。本試驗結(jié)果再次顯示了,vd升高與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移加快的一致性,并且與vegf表達的升高也有正性相關(guān)

10、性。中醫(yī)活血化瘀法及其方藥治療腫瘤有悠久的歷史和確切的療效。對其機制的討論,既往是從抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、增強免疫等方面進展。川芎為常用的活血化瘀中藥,本試驗再次證明了其主要成分川芎嗪有抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。試驗結(jié)果還顯示川芎嗪抗腫瘤機制與抑制vegf表達,降卑微血管密度親密相關(guān)。這與既往報道川芎嗪增強機體免疫3149-152或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡494-96而抑制腫瘤生長的機制不同。有關(guān)活血化瘀中藥的現(xiàn)代藥理作用研究成果豐碩,但尚未見到有關(guān)抑制vegf表達及抗實體瘤血管生長的報道。這一試驗結(jié)果打破了既往關(guān)于活血化瘀中藥促進缺血壞死組織側(cè)枝循環(huán)的建立,改善心血管功能,改善血液流變學(xué),抗血栓形成,鎮(zhèn)

11、痛、鎮(zhèn)靜、抗炎,抗增生等認(rèn)識的局限,從一個全新的角度認(rèn)識了活血化瘀中藥的現(xiàn)代藥理作用。尤其是活血化瘀中藥促進側(cè)枝循環(huán)與抑制新血管生成之間的關(guān)系與條件,是否因為詳細(xì)藥物而有別,一味中藥是否對于不同病理狀態(tài)可表現(xiàn)出不同的作用等,都有深化研究的必要。許多中醫(yī)診斷為“瘀血的病癥如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病血管損害、動脈粥樣硬化等,都有病理性的新血管增生。中醫(yī)均以活血化瘀為主治療,其異病同治的共同機制是否與抑制vegf有關(guān),研究這一問題能從一個角度提醒傳統(tǒng)中醫(yī)治法與方藥的作用本質(zhì)?！緟⒖嘉墨I】1eidnern，seplejp，elhr，etal.turangigenesisandetastasisrr

12、elatinininvasivebreastarinaj.nengljed，1991,324(1):1-8.2rssj，laessn-elshl.fgfandvegffuntininangigenesis:signallingpathays，bilgialrespnseandtherapeutiinhibtinj.tips,2001,22(4):201-204.3劉錦蓉.川芎嗪抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及其機理j.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1993，7(2):149-152.4劉寶瑞,徐修禮,劉文超,等.4種中藥制劑對人肺癌a549細(xì)胞增殖的影響j.中國藥理學(xué)通報,2002,18(1):94-96.5程曉東

13、,郭峰,劉嘉湘,等.中藥扶正方對小鼠leis肺癌的療效及其免疫學(xué)機理的研究j.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1997,17(2):88-90.6hany,hengrs，yedt.pstnatalhangesfvasularendthelialgrthfatr(vegf)expressinintheretinaefnralandhypertensiveratsj.lifesiene,2000,66(17):1615-1625.7趙利枝,楊日芳,汪海.內(nèi)皮細(xì)胞與血管形成j.中國藥理學(xué)通報,2002,18(4):361-364.8zhuz,ittel.inhibitinfturgrthandetastasisbytargetingtur-assiatedangigenesisithantagniststthereep2trsfvasularendsthelialgrthfatrj.investnedrugs，1999,17(3):195-212.9elnyk，shuana，kikj.vasularendthelialgrthfa2trprtesturdisseinatinbyaehanisdistitfritseffetnpriaryturgrthj.anerres,1996,56(4):921-924.10ti，knds，suzukih，etal.qaun