1、結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞活動中癌基因產(chǎn)物cortactin的作用【摘要】目的討論癌基因es1表達產(chǎn)物皮層蛋白(rtatin)與結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞運動的關(guān)系。方法采用共聚焦顯微鏡檢測人結(jié)腸癌細胞株ht29細胞內(nèi)rtatin與內(nèi)吞過程功能蛋白rab5及rab11的分布情況，以及rtatin和組成性內(nèi)吞標記轉(zhuǎn)鐵蛋白(tfn)的關(guān)系。采用病毒轉(zhuǎn)染的方法，將外源性全長rtatin及其突變體轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞內(nèi)，觀察過表達皮層蛋白及其變異體對細胞內(nèi)吞活動的影響。進一步采用esternblt和免疫熒光分析方法檢測rtatin磷酸化與tfn內(nèi)吞在時間和劑量上的關(guān)系。結(jié)果rtatin與rab5/11及tfn在ht29細胞內(nèi)共定位

2、。當ht29細胞過表達皮層蛋白氨基端或羧基端缺失的突變體時，細胞的內(nèi)吞活動受到削弱，而表達全長皮層蛋白或載體的對照組未受明顯影響。同時發(fā)現(xiàn)rtatin的磷酸化與tfn內(nèi)吞呈時間和劑量依賴關(guān)系。結(jié)論rtatin在結(jié)腸癌細胞ht29的內(nèi)吞活動中發(fā)揮作用，其功能的發(fā)揮可能依賴其氨基端和羧基端構(gòu)造區(qū)域。在內(nèi)吞過程中，皮層蛋白發(fā)生磷酸化?！娟P(guān)鍵詞】結(jié)腸癌皮層蛋白細胞內(nèi)吞0引言結(jié)腸癌是主要的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國逐年上升。盡管各種治療方法在不斷改進，但其預后始終不太理想。究其原因，主要是對結(jié)腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移缺乏強有力的干預。近來的研究發(fā)現(xiàn)，與所有的惡性腫瘤一樣，在結(jié)腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，侵襲性偽足

3、(invadpdia)的形成發(fā)揮了非常重要的作用1。細胞通過侵襲性偽足附著于細胞外基質(zhì)并產(chǎn)生溶解細胞的物質(zhì)打破基質(zhì)屏障向周圍侵襲2。細胞的內(nèi)吞作用在此過程中發(fā)揮重要作用35，因此,以癌細胞內(nèi)吞活動為切入點,將有助于理解癌細胞侵襲性偽足的作用過程及轉(zhuǎn)移機制。然而到目前為止，有關(guān)結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞過程的機制還不清楚。有研究說明，癌基因es1的表達產(chǎn)物rtatin皮層蛋白對細胞內(nèi)吞活動的實現(xiàn)起關(guān)鍵作用6，但該分子在結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞活動中的作用如何尚未見研究報道。本實驗通過分析結(jié)腸癌細胞中皮層蛋白與癌細胞內(nèi)吞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rtatin的表達影響結(jié)腸癌細胞的內(nèi)吞活動。rtatin的氨基端和羧基端對于rtatin

4、在內(nèi)吞過程中發(fā)揮功能起關(guān)鍵作用。同時發(fā)現(xiàn)rtatin在結(jié)腸癌細胞的內(nèi)吞過程中發(fā)生磷酸化。本文對此作首次報道。1材料和方法1.1材料1.2方法采用stata7.0軟件，作方差分析，p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1結(jié)腸癌細胞內(nèi)rtatin與rab5和rab11及內(nèi)吞的轉(zhuǎn)鐵蛋白顆粒的定位關(guān)系rab蛋白家族是調(diào)控真核細胞囊泡運輸?shù)闹饕鞍踪|(zhì)，rab5主要負責調(diào)控細胞內(nèi)吞過程中胞吞泡與初級內(nèi)體的交融，rab11主要定位于循環(huán)內(nèi)體。我們在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：結(jié)腸癌細胞內(nèi)rtatin呈彗星尾狀紅色與rab5/11蛋白綠色互相關(guān)聯(lián)，見圖1。同樣，在吞噬fit標記的tfn的結(jié)腸癌細胞內(nèi)，rtati

5、n呈彗星尾狀與tfn發(fā)生共定位，見圖2。2.2癌細胞過表達外源性rtatin及其變異體對tfn內(nèi)吞的影響rtatin分子由5個重要的功能區(qū)組成，包括氨基端的180aa區(qū)域、羧基端sh3構(gòu)造域等,見圖3。為進一步研究rtatin分子如何與結(jié)腸癌細胞的內(nèi)吞活動發(fā)生關(guān)系，我們設(shè)計了rtatin的突變體，包括氨基端缺失(nd)、羧基端缺失(sd)突變，將全長rtatint及突變體編碼dna克隆到帶綠色熒光蛋白(gfp)的病毒載體gin，并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞ht29獲得穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒的細胞株。細胞分成四組：t組表達全長rtatin，nd組表達n端180aa缺失rtatin變異體，sd組表達端sh3缺失的r

6、tatin變異體，gin組空載體，作為對照。為觀察癌細胞的內(nèi)吞活動，一方面，我們將癌細胞與帶紅色熒光標記物的轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)生作用，在熒光顯微鏡下觀察癌細胞內(nèi)的tfn顆粒的數(shù)量以及與rtatin的互相關(guān)系；另一方面，我們將癌細胞與生物素標記的tfn發(fā)生作用，并以elisa法檢測不同細胞內(nèi)吞的tfn數(shù)量，以評價細胞的內(nèi)吞活動的變化情況。a:rtatin;b:reb5;:erge;d:rtatin;e:rab11;f:erge圖1rtatin呈彗星尾狀與rab5/11共定位于細胞漿略fig1rtatinlikeettailasbservedlalizedithrab5/11inytplasina:rta

7、tin;b:tfn5;:erge略圖2彗星尾狀的rtatin與fit標記的tfn共定位于細胞漿略fig2rtatinlikeettailaslalizedithtransferrinlabelledbyfitinytplas圖3rtatin的分子構(gòu)造示意圖略fig3leularnstitutinfrtatin共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，表達全長rtatin的結(jié)腸癌細胞內(nèi)，外源性rtatin綠色，見圖4a與癌細胞內(nèi)吞的tfn紅色，見圖4a互相關(guān)聯(lián)；而在表達rtatin突變體的細胞內(nèi)，突變體rtatin分子和內(nèi)吞的tfn不發(fā)生關(guān)聯(lián)，與全長rtatin不同。elisa法檢測各組細胞tfn內(nèi)吞量，t組與

8、gin組細胞tfn內(nèi)吞量均較多，且數(shù)量相似，差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)；nd組和sd組與t和gin組相比較細胞tfn內(nèi)吞量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)，見圖5。實驗結(jié)果提示，rtatin的氨基端和羧基端對于rtatin在內(nèi)吞過程中發(fā)揮功能起重要作用。2.3rtatin在tfn內(nèi)吞過程中發(fā)生磷酸化，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴關(guān)系采用esternblt方法從蛋白程度檢測rtatin磷酸化與tfn內(nèi)吞活動之間的關(guān)系。圖6顯示，隨著細胞內(nèi)bitfn數(shù)量的增多，rtatin磷酸化的量逐漸增多。另一方面，隨著內(nèi)吞活動的延長，rtatin磷酸化的量逐漸增多，細胞內(nèi)吞的轉(zhuǎn)鐵蛋白量也逐漸增多。a:rt

9、atin(t);b:rtatin(nd);:gin;d:rtatin(sd)greenasrtatinlabelledbygfp,redasttfnlabelledbyredfluresene圖4表達全長rtatin和突變rtatin的結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白(tfn)的內(nèi)吞情況略fig4transferrinuptakeinellsexpressinhlertatinrutatinalrtatin*：與gin組比較p0.05,*：與gin組比較p0.05圖5elisa法檢測各組結(jié)腸癌細胞tfn內(nèi)吞量略fig5transferrinuptakeineahgrupflnanerellsasanalyz

10、edbyelisathelevelfrtatinphsphrylatinasinreasedhentransferrinuptakeinatieanddsedependentanner圖6rtatin磷酸化蛋白印跡分析結(jié)果略fig6theresultsfrtatinphsphrylatinanalyzedbyesternblt同時，我們采用免疫熒光的方法觀察了癌細胞內(nèi)吞活動中rtatin磷酸化的情況。圖7顯示，30g/ltfn處理的細胞內(nèi)rtatin磷酸化程度比10g/ltfn處理細胞內(nèi)的rtatin磷酸化程度增高。當沒有tfn處理時，rtatin磷酸化較少,見圖8。研究結(jié)果提示，rtatin

11、在結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞過程中發(fā)生磷酸化改變，rtatin的磷酸化是否為癌細胞的內(nèi)吞活動必須的事件，值得進一步討論。3討論在惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，侵襲性偽足的形成發(fā)揮了非常重要的作用。癌細胞通過侵襲性偽足附著于細胞外基質(zhì)并產(chǎn)生溶解細胞的物質(zhì)打破基質(zhì)屏障向周圍侵襲。侵襲性偽足發(fā)揮作用與癌細胞的內(nèi)吞活動有親密關(guān)系。癌細胞在侵襲過程中通過內(nèi)吞活動傳遞有關(guān)細胞內(nèi)外的分子信號。因此將癌細胞的內(nèi)吞活動作為研究的切入點將有利于我們認識癌細胞的侵襲過程。網(wǎng)格蛋白介導的細胞內(nèi)吞是細胞攝取營養(yǎng)至胞內(nèi)以及轉(zhuǎn)導胞內(nèi)外信號的重要途徑。這一過程大致分為四個根本步驟：1配體與膜受體結(jié)合形成一個細胞膜小窩(pit);2小窩逐漸

12、向內(nèi)凹陷。脫離細胞膜形成一個包被小泡;3包被小泡解聚,形成初級內(nèi)體;4初級內(nèi)體與溶酶體交融,吞噬的物質(zhì)被溶酶體的酶水解；內(nèi)體以出芽形式形成運載受體的小囊泡，返回細胞質(zhì)膜710。近來研究說明，細胞的內(nèi)吞過程必須有細胞內(nèi)肌動蛋白(atin)聚合活動的參與，而皮層蛋白rtatin在細胞內(nèi)肌動蛋白的聚合過程中發(fā)揮重要作用7，11。這些發(fā)現(xiàn)促發(fā)我們對rtatin在內(nèi)吞過程中作用的研究設(shè)想。圖7結(jié)腸癌細胞在不同數(shù)量的tfn處理后，rtatin磷酸化程度的變化略fig7thelevelfrtatinphsphrylatinashangedafterthelnanerellseretreatedithtran

13、sferrin圖8對照組，無tfn處理時，rtatin磷酸化程度低下fig8ntrlgrup,ithutbeingtreatedithtransferrin,thelevelfrtatinphsphrylatinasler在腫瘤的進展過程中，癌基因及其編碼蛋白發(fā)揮重要作用。皮層蛋白rtatin由癌基因es1編碼，同時，rtatin也是癌基因sr的主要作用底物,rtatin在sr信號途徑發(fā)揮特殊功能12。研究說明，rtatin在結(jié)腸癌細胞中表達，對癌細胞的運動發(fā)揮作用1314。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其存在共定位現(xiàn)象，rtatin表現(xiàn)為彗星尾狀與rab5/11或tfn互相關(guān)聯(lián)。rab蛋白家族是調(diào)控真核細胞

14、囊運輸?shù)闹饕鞍踪|(zhì)，屬于ras相關(guān)的小gtp酶，其中rab5主要負責調(diào)控胞吞過程中胞吞泡與初級內(nèi)體的交融，是早期胞吞過程中的一個重要的限速成分，rab5agdi復合體是配體可以進入有被小泡所必需的構(gòu)造1516，rab11定位于循環(huán)內(nèi)體上，是細胞內(nèi)吞過程中內(nèi)體的功能元件1718。轉(zhuǎn)鐵蛋白(tfn)內(nèi)吞是細胞典型的內(nèi)吞活動，常被用作內(nèi)吞研究的模型。tfn被細胞攝取在細胞內(nèi)的位置，顯示細胞內(nèi)吞過程的途徑。rtatin與rab5/11及tfn有共定位現(xiàn)象，提示rtatin的活動與細胞的內(nèi)吞過程有一定關(guān)系。為進一步研究rtatin在結(jié)腸癌細胞內(nèi)吞中的作用，我們構(gòu)建rtatin及其突變體重組質(zhì)粒，用共聚焦

15、顯微鏡和elisa法檢測細胞內(nèi)吞tfn的情況。結(jié)果顯示rtatin羧基或氨基端缺失的突變體表達細胞，對于tfn的內(nèi)吞活動明顯減少。結(jié)果提示rtatin的氨基端和羧基端對于rtatin在細胞內(nèi)吞過程中發(fā)揮功能起關(guān)鍵性作用。由于rtatin是癌基因sr的作用底物，sr作為一種酪氨酸激酶促使rtatin磷酸化而使rtatin傳遞上游信號19。sr信號途徑在腫瘤的侵襲過程發(fā)揮重要作用20。由此我們推想在癌細胞的內(nèi)吞活動中rtatin是否存在磷酸化變化。我們通過初步試驗發(fā)現(xiàn)答案是肯定的。我們推測rtatin可能通過其磷酸化程度來影響結(jié)腸癌細胞的內(nèi)吞作用，這值得進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1eavera.in

16、vadpdia:speializedellstruturesfranerinvasinj.linexpetastasis,2022,23(2):97105.2bdenet,barth,thasd,etal.aninvasinrelatedplexfrtatin,paxillinandpkuassiatesithinvadpdiaatsitesfextraellularatrixdegradatinj.ngene,1999,18(31):44404449.3kruhtenae,nivena.dynainasaverandpinherduringelligratinandinvasinj.ells

17、i,2022,119(pt9):16831690.4buiner,rthjd,nivena.ftanduth:pdses,invadpdiaandirulardrsalrufflesj.natrevlellbil,2022,5(8):647657.5panpj,dt,thpsne,etal.phagytsisfrsslinkedgelatinatrixbyhuanbreastarinaellsrrelatesiththeirinvasiveapaityj.linanerres,1998,4(2):507515.6jianeiz,kangz,jianjiangh,etal.regulatinfr

18、tatin/dynaininteratinbyatinplyerizatinduringthefissinflathrinatedpitsj.jurnalfellsiene,2022,118(4):807817.7henl,angz,zhuj,etal.rlesfrtatin,anatinplyerizatinediatr,inellendytsisj.atabihibiphyssin(shanghai),2022,38(2):95103.8usina.synaptivesileendytsis:aliurksvertieinthenerveterinalj.lneurbil,2000,22(13):115128.9hinshaje.dynainanditsrleinebranefissinj.annurevelldevbil,2000,16(1):483519.10qu