1、蛋白免疫印跡（Western Blot）生物試驗培訓(xùn)系列之三第1頁 WB基礎(chǔ)一目 錄2 試驗步驟與結(jié)果分析三 試驗室常見問題解答四 試劑與設(shè)備二第2頁目 錄31.WB概念2.WB應(yīng)用3.WB原理4.WB特點 WB基礎(chǔ)一 試驗步驟與結(jié)果分析三 試驗室常見問題解答四 試劑與設(shè)備二第3頁1.1 蛋白免疫印跡概念是將電泳分離后總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原一個蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。4第4頁1.2 蛋白免疫印跡應(yīng)用基因在蛋白水平表示研究例： 吳德平,王穎等.立氏立克次體蛋白抗原基因表示和重組蛋白抗原 免疫印跡分析J.中國人獸共患病學(xué)報,25(10):931-

2、934.抗體活性檢測例：胡紀(jì)文，馬東禮.免疫印跡法檢測血清幽門螺桿菌抗體應(yīng)用價值J. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志,13(8):952-956.疾病早期診療例：諸延慧，容瓘等.酶聯(lián)免疫印跡術(shù)(EITB)在小鼠日本血吸蟲感染早期 診療中應(yīng)用J. 中國人獸共患病雜志,1993,9(3):26-29.5第5頁1.2 蛋白免疫印跡應(yīng)用檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在例：李桂波.利用免疫印跡法釣取PC3M細(xì)胞中與人前列腺癌高轉(zhuǎn)移相關(guān)特異性短肽結(jié)合蛋白研究D.吉林:吉林大學(xué),.對特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析例：6第6頁1.3 WB原理WB采取是聚丙烯酰氨凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)識二抗。經(jīng)過特異

3、性抗體對凝膠電泳處理過蛋白質(zhì)進(jìn)行著色。經(jīng)過分析著色位置和著色深度取得特定蛋白質(zhì)在所分析細(xì)胞或組織中表示情況信息。7第7頁1.4 WB特點WB是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原、抗體檢測基礎(chǔ)上發(fā)展起來檢測蛋白質(zhì)技術(shù)SDS凝膠電泳：高分辨率抗原抗體反應(yīng)：特異性轉(zhuǎn)膜：靈敏度8第8頁目 錄91.試劑2.耗材3.設(shè)備 WB基礎(chǔ)一 試驗步驟與結(jié)果分析三 試驗室常見問題解答四 試劑與設(shè)備二第9頁2.1 試劑甲叉雙丙烯酰胺TrisHCLSDS10第10頁丙烯酰胺過硫酸銨TEMED2.1 試劑11第11頁RIPA裂解液SDSloading Buffer封閉液ECL顯影液2.1 試劑12第12頁2.1 試劑配置聚丙烯酰胺儲

4、存液： 29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺 、加 H2O至 100mL。注意事項:應(yīng)以溫?zé)崛ルx子水配制儲于棕色瓶，4避光保留。嚴(yán)格核實pH不得超出7.0，因光催化或堿催化能夠發(fā)生脫氨基反應(yīng)。使用期不得超出兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，能夠過濾。13第13頁2.1 試劑配置分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8): 18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8): 6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到1

5、00mL終體積。注意事項:過濾后4保留。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)整pH值，而不用 Tris-HCL。 轉(zhuǎn)移緩沖液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至總量1L。14第14頁2.1 試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液: pH6.80.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用。按1:1或1:2百分比與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，普通為 20-25L，總蛋白量100g。Tris緩沖鹽溶液(TBS): 20mmo

6、l/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸電泳緩沖液: 30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL，臨用前稀釋 10 倍。15第15頁2.2 耗材移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶離心管燒杯96孔板PVDF 膜海綿墊16第16頁2.3 設(shè)備垂直電泳儀化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)臺式離心機(jī)17第17頁2.3 設(shè)備高壓滅菌鍋電子天平電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱18第18頁2.3 設(shè)備磁力攪拌器4、-20冰箱19第19頁目 錄201.試驗步驟2.結(jié)果分析3.注意事項 WB基礎(chǔ)一 試驗步驟與結(jié)果分析三 試驗室常見問題解答四 試劑與設(shè)備二第20頁3.

7、1 試驗步驟蛋白樣品制備蛋白含量測定21第21頁3.1.1 蛋白樣品制備在六孔板中，按照一個孔添加150L百分比添加適量RIPA裂解液，用槍吹打均勻以充分接觸細(xì)胞。樣品放置冰上30min（中間混勻5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150L裂解液，若細(xì)胞密度非常高能夠適當(dāng)加大裂解液用量至200L或250L。第22頁a).配制BCA工作液：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。b).將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品和工作液按

8、下表加入到96孔板中，混勻。23管號試劑(L)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管213233x3435363蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)01246810蒸餾水(L)10986420待測樣(L)10BCA工作液(L)2002002002002002002002003.1.2 蛋白含量測定第23頁3.1.2 蛋白含量測定c).混勻后，在37烘箱中溫浴30min，冷卻至室溫。d).酶標(biāo)儀562nm波長下測定吸光度。e).以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。f).用測定孔平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)蛋白質(zhì)含量。24第24頁3.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳所帶負(fù)電荷大大超出了蛋白質(zhì)分子原有電荷量，從而

9、消除了不一樣分子之間原有電荷差異。25上樣緩沖液作用SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)在強(qiáng)還原劑（-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間二硫鍵斷裂蛋白質(zhì)(SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物)-第25頁3.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE膠聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸銨作用下聚合，形成膠。分子篩效應(yīng)26第26頁清洗玻璃板配膠上樣電泳停頓電泳27玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠配分離膠，加入TEMED后馬上搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時即可。然后膠上加一層水，液封后膠凝更加快。（加水液封時要很慢，不然膠會被沖變型。）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說

10、明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后馬上搖勻即可灌膠。將剩下空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子兩邊豎直向上輕輕將其撥出。（插梳子時要使梳子保持水平。）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字一面面向外。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳第27頁清洗玻璃板配膠上樣電泳停頓電泳28測完蛋白含量后，計算含50mg蛋白溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：15*Loading Buffer于離心管，100水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min

11、，13000rpm，4。加足夠1*電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液最少要漫過內(nèi)測小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸收樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中遲緩加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳第28頁清洗玻璃板配膠上樣電泳停頓電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)識，將膠泡在清水中。293.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳第29頁3.1.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳30清洗玻璃板配膠上樣電泳停頓電泳第30頁3.1.4 轉(zhuǎn)膜剪PVD

12、F膜，并提前切個角，甲醇中泡約30秒，在放入蒸餾水中2min。將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉(zhuǎn)膜液中，平衡最少5min。（轉(zhuǎn)膜液可回收）打開電轉(zhuǎn)印夾，在黑色面一次放入海綿墊、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿墊31轉(zhuǎn)膜條件：45V，1.5h第31頁3.1.5 封閉用1TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉(26,80rpm/min, 2-4h)。32第32頁3.1.6 一抗雜交棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液稀釋一抗雜交溶液, 置于4雜交過夜或在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26,80rpm/min,1h)33第33頁3.1.7 二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3

13、次(置于振蕩培養(yǎng)箱中,26,80rpm/min,10min/每次)棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋二抗雜交溶液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26,80rpm/min,1h); 34第34頁WB顯色分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物 呈色DAB35第35頁放射自顯影原理：利用放射性核素發(fā)射射線，使感光材料中鹵化銀等感光，顯出影像后進(jìn)行放射性標(biāo)識物定位和定量測量技術(shù)。特點：靈敏度高、分辨率好、保留時間長久，但因為試驗所用方式性物質(zhì)對人體有輻射作用。應(yīng)用：多用于研究標(biāo)識化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。第36頁底物化學(xué)發(fā)光ECL原理:化學(xué)

14、發(fā)光是在一些特殊化學(xué)反應(yīng)中吸收了反應(yīng)釋放化學(xué)能,而處于電子激發(fā)態(tài)反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時所產(chǎn)生一個光輻射,化學(xué)發(fā)光分析是依據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物光輻射(化學(xué)發(fā)光)確定物質(zhì)含量一個痕量分析方法。特點:靈敏度高和線性范圍寬，不需要任何光源。第37頁底物熒光ECF原理：是利用熒光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）標(biāo)識二抗，標(biāo)識熒光染料二抗分別對應(yīng)對應(yīng)目標(biāo)蛋白，以此實現(xiàn)經(jīng)過檢測熒光染料信號強(qiáng)度，實現(xiàn)種蛋白信號檢測，以進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。熒光檢測Western Blot原來不是檢測主流方法，不過熒光法檢測允許在同一張轉(zhuǎn)印膜上用不一樣顏色熒光底物同時檢測不一樣目標(biāo)。第38頁底物DAB呈色原理：二氨基

15、聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根過氧化物酶最敏感、最慣用顯色底物，反應(yīng)產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（Western Blot,WB)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)、斑點印跡(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等染色和顯色反應(yīng)。用之進(jìn)行對底物顯色即被稱為底物DAB呈色法。此技術(shù)成本低，操作也較簡單是慣用western blot成像分析技術(shù)之一，不過因為其靈敏度稍低，在目標(biāo)蛋白表示量較少情況下可能沒有理想結(jié)果應(yīng)慎用。第39頁3.1.8

16、 顯影檢測棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩培養(yǎng)箱中，26， 80rpm/min, 10min/每次）；ECL工作液配制：等體積混合Detection reagent 1和Detection reagent 2，現(xiàn)配現(xiàn)用。依據(jù)膜大小，按每10平方厘米膜加1mL ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1分鐘。 利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集圖像和進(jìn)行圖像分析。40第40頁3.2 結(jié)果分析41第41頁3.3 注意事項42電泳結(jié)束后，應(yīng)及時用清洗潔凈玻璃板，清洗時應(yīng)使用海綿擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及時沖洗電泳槽，以免鹽離子沉積，造成電泳絲腐蝕；注意海綿

17、墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠疊放位置，以確保正確轉(zhuǎn)印方向；注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠相對大小，以免造成短路；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時取出轉(zhuǎn)印膜，并馬上用TBST漂洗1-2遍，并馬上加入封閉液，這么能夠防止膜上雜質(zhì)殘留或膜變干造成背景高問題；第42頁 WB基礎(chǔ)一目 錄43 試驗步驟與結(jié)果分析三 試驗室常見問題解答四 試劑與設(shè)備二第43頁常見問題解答沒信號膜一片空白，沒有任何條帶，陽性對照樣品也無條帶：試驗失敗？抗體失效？重新進(jìn)行試驗，重新稀釋抗體；膜一片空白，沒有任何條帶，陽性對照樣品有條帶：試驗樣品降解？試驗樣品無該蛋白表示？轉(zhuǎn)膜效率過低？重新進(jìn)行試驗，復(fù)核查找上述原因，以

18、尋找對策。背景過高目標(biāo)條帶以外區(qū)域有信號，假如是片狀，甚至整塊膜，普通是封閉不好，膜變干，一抗非特異雜交或二抗非特異雜交造成；假如是條紋狀，普通是因為膜上有壓痕造成，假如是點狀，普通是膜上有雜質(zhì)，或泡膜時膜沒有充分浸泡；轉(zhuǎn)膜效率過低。44第44頁常見問題解答一抗效價低：提升一抗稀釋百分比，提升雜交時間，降低洗膜次數(shù)，提升曝光時間，提升上樣量；轉(zhuǎn)膜效率低：檢測轉(zhuǎn)膜試劑和耗材，優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；在目標(biāo)帶以外信號條帶為雜帶，普通因為一抗特異性不好所造成，假如目標(biāo)帶比雜帶信號強(qiáng)，可經(jīng)過減低一抗稀釋百分比，并縮短雜交時間處理；假如目標(biāo)帶比雜帶信號弱，在不減低一抗稀釋百分比前提下，縮短雜交時間；并提升TBST

19、緩沖液NaCl濃度提升到500nM；雜帶假如與目標(biāo)帶位置相距較遠(yuǎn)，能夠不優(yōu)化試驗，直接裁剪即可，雜帶假如與目標(biāo)帶位置相距較進(jìn)，應(yīng)調(diào)整膠濃度，并延長電泳時間。有雜帶目帶弱45第45頁兩塊玻璃板之間灌膠,膠為何總是不平?46玻璃未洗凈過硫酸銨和TEMED加量過多可造成膠凝固過快而使膠不平加入試劑后未搖勻，造成局部聚合劑濃度過高，聚合較快而使膠不平加入不均勻，應(yīng)注意手法灌膠后應(yīng)進(jìn)行壓膠(可用水或正丁醇)溫度會影響膠聚合，若受熱不均勻，也會影響膠聚合不均勻。第46頁為何會有“微笑”和“倒微笑”這么效果呢？47 微笑是因為灌膠時候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，造成凝膠中分子有不一樣遷移率所致。這種情況在

20、較厚凝膠以及垂直電泳時經(jīng)常發(fā)生。 “倒微笑“也稱“皺眉”現(xiàn)象經(jīng)常是因為垂直電泳時電泳槽裝置不適當(dāng)引發(fā)，尤其是當(dāng)凝膠和玻璃板組成三明治底部有氣泡或靠近隔片凝膠聚合不完全便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象；中間部分和兩端受熱不一樣而致成了“倒微笑”可能是因為兩端膠凝不好，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。第47頁Western-blot制膠時好多泡泡怎么辦？48玻璃板需用洗潔精洗后再用雙蒸水沖洗，晾干配膠時應(yīng)沿管壁緩緩加入各成份，用手輕輕搖勻；若用槍頭吹打需遲緩且不要打到頭倒膠時，用槍沿一側(cè)緩緩加入，不要打到底，以免帶入氣泡封膠時，可用200L槍加水，減小壓力，以免把膠沖起室溫制膠時，因為溫差及凝膠聚合反應(yīng)放熱可

21、產(chǎn)生氣泡分離膠凝好后，倒掉里面水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，快速插梳子第48頁問答時間49第49頁WB標(biāo)準(zhǔn)試驗-試劑耗材與設(shè)備試劑：SDSRIPA裂解液丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺TEMEDECL顯影液封閉液TrisHCL過硫酸銨SDSloading Buffer50耗材：離心管燒杯96孔板PVDF 膜海綿墊移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶設(shè)備：臺式離心機(jī)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)垂直電泳儀電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱電子天平高壓滅菌鍋磁力攪拌器4、-20冰箱第50頁WB標(biāo)準(zhǔn)試驗-試劑配置聚丙烯酰胺儲存液： 29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺 、加 H2O至 100ml。分離膠緩沖液(1.5mmol/LT

22、ris-HCL(pH8.8): 18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8): 6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100mL終體積。轉(zhuǎn)移緩沖液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL 甲醇，加水至總量 1L。51第51頁SDS蛋白上樣緩沖液: pH6.80.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用

23、。按1:1或1:2百分比與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，普通為 20-25L，總蛋白量100g。Tris緩沖鹽溶液(TBS): 20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。10 xTris-甘氨酸電泳緩沖液: 30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL。 臨用前稀釋 10 倍。52WB標(biāo)準(zhǔn)試驗-試劑配置第52頁WB標(biāo)準(zhǔn)試驗流程在六孔板中，按照一個孔添加150L百分比添加適量RIPA裂解液，用槍吹打均勻以充分接觸細(xì)胞。樣品放置冰上30min（中間混勻5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g離心3

24、-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)PAGE、Western和免疫沉淀等操作53樣品制備第53頁WB標(biāo)準(zhǔn)試驗流程54含量測定管號試劑(L)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管213233x3435363蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)01246810蒸餾水(L)10986420待測樣(L)10BCA工作液(L)200200200200200200200200配制BCA工作液：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品和工作液按表1加入到96孔板中，混勻。在37烘箱中溫浴30min，冷卻至室溫。酶標(biāo)儀562nm波長下測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐

25、標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測定孔平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)蛋白質(zhì)含量第54頁清洗玻璃板配膠上樣電泳玻璃板對齊放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠配分離膠，加入TEMED馬上搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置，膠上加一層水，液封后膠凝更加快。（加水液封時要很慢，不然膠會被沖變形）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后馬上搖勻即可灌膠。將剩下空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（插梳子時要使梳子保持水平）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外

26、。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字一面面向外。）測完蛋白含量后，計算含50mg蛋白溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：15*Loading Buffer于離心管，100水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4。加足夠1*電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液最少要漫過內(nèi)測小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸收樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中遲緩加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）停頓電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)識，將膠