1、表觀遺傳學(xué)第二章 DNA甲基化A Symphonic ExampleA Symphonic Example拉爾夫沃恩威廉姆斯 (Ralph Vaughan Williams)，作于1910Epigenetic differences：monozygotic twins內(nèi)容綱要一、DNA的甲基化二、真核生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶三、DNA去甲基化四、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑一、DNA甲基化 (1)1. DNA甲基化：在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferase, DNMTs) 的作用下，將一個(gè)甲基添加的胞嘧啶的5-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine)

2、 2.胞嘧啶甲基化后產(chǎn)生5-甲基化胞嘧啶能夠自發(fā)的脫氨基形成胸腺嘧啶 (Thymine)：5mC - T3. 哺乳動(dòng)物中，1%的DNA堿基能夠發(fā)生甲基化修飾4. DNA甲基化的分布：(1)轉(zhuǎn)座子(2) 逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的重復(fù)序列(3) 大多數(shù)功能基因的編碼區(qū)一、DNA甲基化 (2)1. DNA甲基化的模式：(1) 線蟲：無甲基化的胞嘧啶(2) 果蠅：極少量的甲基化胞嘧啶，識(shí)別模式CpT (主要) vs. CpG (極少)(3) 哺乳動(dòng)物：CpG (70%)或者CpNpG2. CpG Cytosine phosphate Guanine3. 鑲嵌的甲基化 (mosaic methylation):

3、 基因組中，高度甲基化的部分DNA序列被大的非甲基化DNA序列所分隔開4. 難以被DNA修復(fù)系統(tǒng)所識(shí)別： CGTG是可遺傳的DNA序列中的四種堿基/核苷DNA甲基化SAH, S-adenosylhomocysteine; SAM, S-adenosylmethionineDNA甲基化DNA甲基化的檢測Bisulfite Modification測序: 非甲基化的C將被測序成T，反鏈為ADNA甲基化位點(diǎn)鑒定的方法精確的功能有待進(jìn)一步研究，一般學(xué)術(shù)界公認(rèn)的兩類功能是:宿主防御模型 (The Host Defence Model)基因調(diào)控模型 (The Gene Regulation Model)D

4、NA甲基化的功能DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制Long-term silencing直接干擾機(jī)制 (1)直接干擾機(jī)制 (2)間接機(jī)制The methyl-CpG-binding proteins MeCP1 and MeCP2能夠與甲基化的DNA結(jié)合MeCP2能夠招募Sin3a, HDACs，形成復(fù)合物，阻遏轉(zhuǎn)錄MeCP2二、真核生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1. 哺乳動(dòng)物: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B，DNMT3L, DNMT22. 擬南芥：DRM2, MET1，DNMT2, CMT33. 粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa): DIM2, dim-5, RIDDNA甲

5、基轉(zhuǎn)移酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶: 系統(tǒng)發(fā)育分析哺乳動(dòng)物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶daughter stranddaughter strandDNMT1: maintenance methyltransferasesDNMT3A & DNMT3B: de novo methyltransferases 胚胎移植過程中高表達(dá)表觀遺傳修飾的重編程配子形成胚胎植入前的發(fā)育精原細(xì)胞滋養(yǎng)外胚層DNA甲基化：Cell MemoryDNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能DNA甲基轉(zhuǎn)移酶物種主要功能DNMT1哺乳動(dòng)物Maintenance，de novo (CpG)DNMT3A哺乳動(dòng)物de novo (CpG)DNMT3B哺乳動(dòng)物de no

6、vo (CpG)DNMT3L哺乳動(dòng)物DNMT3輔助因子，無活性中心DNMT2哺乳動(dòng)物tRNAAsp的甲基化DRM2擬南芥de novo (CpN)MET1擬南芥Maintenance (CpG)DNMT2擬南芥未知CMT3擬南芥Maintenance (CpNpG)DIM2粗糙脈孢菌de novo (CpN)RID粗糙脈孢菌RIP 必須DNA甲基化的通路：哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的甲基化(a) 未知蛋白質(zhì)因子X失去，DNMT結(jié)合，促使啟動(dòng)子甲基化(b) 聚合酶失去，DNMT結(jié)合-甲基化(c) 某些轉(zhuǎn)錄因子招募DNMT到啟動(dòng)子區(qū)域，促使甲基化(d) 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)招募DNMTDNA甲基化的通路

7、：擬南芥1. TXN：Transcription2. 擬南芥中大多數(shù)全新甲基化由siRNA介導(dǎo)3. DRM2: de novo; MET1: MaintenanceDNA甲基化：哺乳動(dòng)物 vs. 植物CpG為什么不被甲基化？DNA甲基化的通路：粗糙脈孢菌1. RIP: repeat-induced point mutationDnmt11. Dnmt1chip/-: Dnmt1的表達(dá)量為正常小鼠的10%；2. 低甲基化3. Dnmt1chip/-小鼠出生體重為正常的70%4. 80%的小鼠4-8個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生淋巴瘤5. 癌基因c-myc表達(dá)量異常增高Dnmt3b1. 小鼠胚胎纖維原細(xì)胞中的Dnmt

8、3b失活導(dǎo)致DNA的低甲基化 (Hypomethylation)，染色體不穩(wěn)定，使癌癥細(xì)胞永生化2. 形成有絲分裂染色體橋3. 轉(zhuǎn)入Dnmt3b能夠恢復(fù)表型Dnmt3a & Dnmt3b表達(dá)特異性：Dnmt3a: ubiquitousDnmt3b: 前額，眼睛Dnmt3a & Dnmt3b對(duì)哺乳動(dòng)物的發(fā)育至關(guān)重要三、DNA去甲基化1. DNA去甲基化 (DNA demethylation): 5甲基胞嘧啶 (5mC) 替代成胞嘧啶的過程2. 兩種方式(1) 主動(dòng)去甲基化 (Active DNA demethylation)A. Bona fide demethylationB. Indirec

9、t demethylation(2) 復(fù)制相關(guān)的去甲基化 (Replication-coupled DNA demethylation)Active DNA demethylation1. 5-甲基胞嘧啶去甲基化酶將5-甲基胞嘧啶水解成胞嘧啶和水2. 5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶將5-甲基胞嘧啶從磷酸二脂鍵骨架中切除，然后通過內(nèi)切酶修復(fù)5-甲基胞嘧啶去甲基化酶5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶5-甲基胞嘧啶去甲基化酶1. 1999年，A549細(xì)胞中提取，MBD2；2. 需要很高的能量：使O-H鍵和C-C鍵斷裂之后，再形成C-O鍵和C-H鍵3. 從熱動(dòng)力學(xué)上可行Bona fide demethyl

10、ation+甲醇+甲醛+二氧化碳+琥珀酸鹽5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶1. MBD2b: MeCP2的同源蛋白質(zhì)Indirect demethylationReplication-coupled DNA demethylationA. 正常B. 核蛋白關(guān)閉C. 乙?；M蛋白的抑制甲基化酶活性的維持甲基化酶活性被關(guān)閉甲基化酶活性被關(guān)閉四、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑1. 核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑2. 非核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑1. 5-azacytidine: 第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的甲基化抑制劑。有細(xì)胞毒性，低劑量能夠治療白血病2. 5-aza-2-deoxycytidine: 誘導(dǎo)細(xì)胞增生的停止3. Zebularine： 5-azacytidine的衍生物4. FCDR：5-Fluoro-2-deoxycytidine 4. 作用機(jī)理：在體內(nèi)通過代謝形成三磷酸脫氧核苷，在DNA復(fù)制過程中代替胞嘧啶，與Dnmts具有很強(qiáng)的結(jié)合力