1、免疫學(xué)檢測Immunological detection免疫檢測是目前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛的方法之一。具有高度精確、靈敏、特異的特點(diǎn)?？捎糜诿庖邔W(xué)以及相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于臨床多種疾病的診斷。生物學(xué)研究 發(fā)病機(jī)理研究免疫疾病診斷 : 病原體的抗原抗體檢測；自身抗體；疾病的療效和預(yù)后判斷。 免疫治療藥物和疫苗的研究 微生物鑒定 動物、植物性狀的免疫標(biāo)記 、生理活動研究（激素、維生素）免疫檢測技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用免疫檢測的優(yōu)點(diǎn)特異性: 抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原并與之結(jié)合, 這種特性是免疫檢測方法的基礎(chǔ)?？蓹z測: 當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀

2、器可檢測出的反應(yīng)現(xiàn)象。應(yīng)用廣：試驗(yàn)時既可用已知抗體檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性：抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？赡嫘裕嚎乖贵w反應(yīng)所形成的復(fù)合物并不穩(wěn)定， 在一定條 件下可解離。（親和力，pH，離子強(qiáng)度）比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象。 （網(wǎng)格理論）階段性：特異性結(jié)合階段（快）和可見反應(yīng)階段（慢，形成抗原/抗體復(fù)合物）?？乖?抗體反應(yīng)的比例性-網(wǎng)格理論（lattice theory）抗體過?？乖^?？乖贵w比例合適沉淀物物形成量抗體量恒定，抗原量遞增Equivalence Lattice formation影響抗

3、原抗體反應(yīng)的因素溫度： 在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度可加速反應(yīng)速度， 縮短反應(yīng)時間，常用反應(yīng)溫度為（37-45C度）溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì)， 影響反應(yīng)結(jié)果，因此溶液的pH應(yīng)適宜（pH 6-8）電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85% NaCl） 參與，否則不出現(xiàn)可見反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)類型中和反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)（Agglutination） 顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱凝集反應(yīng)。 直接凝集： 將顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 間接凝集： 將可溶性抗原包被在載體顆粒表面，與

4、相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象?？扇苄钥乖ㄑ宓鞍?、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（Precipitation)液相沉淀反應(yīng)凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡絮狀沉淀試驗(yàn)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋，加入一定濃度的適量抗體，產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比例。 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)主要用于抗原的定性試驗(yàn)。用已知抗體來檢測未知抗原。 （診斷

5、炭疽的Ascoli實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌分型、血跡鑒定）。 液相沉淀反應(yīng)凝膠擴(kuò)散沉淀指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠（PAGE）等。最常用的方法為： 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔。加入待測的抗原，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散，并合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出

6、現(xiàn)沉淀線。常用于抗原或抗體的定性檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。Ag1Ag1Ag1Ag1Ag2Ag4Ag1+Ag2免疫電泳技術(shù) (immuno-electrophoresis)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。加快了沉淀反應(yīng)的速度。利用蛋白質(zhì)其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)。免疫電泳包括: 血清免疫電泳 對流免疫電泳 火箭電泳 免疫印跡 （Western blot） 血清免疫電泳將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離。沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加?；鸺庖唠娪?稱作單向電泳擴(kuò)

7、散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。沉淀線的高度與抗原量成正比免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。免疫標(biāo)記技術(shù) 酶免疫技術(shù) 熒光免疫技術(shù) 放射免疫技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，酶標(biāo)檢測儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：和用于檢測可溶性抗

8、原或抗體，酶免疫組化法：用于檢測組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶免疫測定法必要的試劑是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）酶作用的底物（顯色劑）基本步驟包 被反 應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗 滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離底 物 顯 色定性或定量的分析常見的檢測方法夾心法（測定抗原）間接法（測定抗體）競爭法（測定抗原或抗體）捕獲包被法（測定IgM抗體） BAS-ELISA法 間接法測抗體 (indire

9、ct ELISA)Ag?待檢抗體 適用于測定二價或二價以上的大分子抗原， 不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原。 雙抗夾心法測抗原 (sandwich ELISA)Antibody coated wellAdd antigenAdd enzyme-conjugated secondary antibodyAdd substrate(s) and measure color 將Ab吸附在固相載體表面。 加入酶標(biāo)Ag和待測Ag，競爭結(jié)合Ab；對照只加入酶標(biāo)Ag。 加底物。 對照孔與樣品孔底物降解量的差未知Ag量。競爭法測定抗原 (competitive ELISA)親和素(avidin)是

10、一種糖蛋白，生物素(biotin)為小分子化合物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可提高ELISA的敏感度。 BAS-ELISA法BAS為生物素(biotin)親和素(avidin)系統(tǒng)(system)BAS-ELISA法 固相支持物； 樣品； 特異性IgG； 生物素化抗小鼠抗體（IgG-Biotin）； 辣根過氧化物酶HRP-親和素（HRP-Avidin）； DAB顯色液； 顯色；Summary（ELISA） 用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法。用熒光顯微鏡觀察熒

11、光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況?？蓪μ囟ǖ牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。免疫熒光技術(shù)AgY熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片AgYY熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片第一抗體直接法間接法待測抗原待測抗原常用熒光染料：顯示綠色熒光：FITC, GFP，Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B, Texas Red, PE， Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa350 ，DAPI免疫熒光染色放射免疫分析（ radioimmunoassay, RIA ）將放射性同位素測量的高度靈敏性、精確性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)

12、合的體外測定超微量物質(zhì)的技術(shù)。通常是標(biāo)記抗原與未標(biāo)抗原競爭有限量的抗體，然后通過測定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中放射性強(qiáng)度的改變，測定出未標(biāo)記抗原量。常用標(biāo)記核素： 125 I 3 H 射 線 半衰期 60.2d 12.3y標(biāo)記方法 簡 單 復(fù) 雜標(biāo)記設(shè)備 低 廉 昂 貴測量條件 簡 單 復(fù) 雜 化學(xué)發(fā)光免疫分析 ( chemiluminescence immunoassay, CLIA） 將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合。 具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期長、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高。 高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)以被廣大研究人員所

13、認(rèn)可，并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測技術(shù)。 常用的化學(xué)發(fā)光底物：魯米諾 (3, 2氨基鄰苯二甲酰肼, lumino) 酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑, 在信號試劑作用下發(fā)光, 用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定，目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP）。 操作步驟與酶免分析完全相同: 以酶標(biāo)記的抗原或抗體,進(jìn)行免疫反應(yīng), 免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物。酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器

14、特殊防護(hù)治理污染三種免疫測定技術(shù)的成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光RMB淋巴細(xì)胞的檢測檢測免疫細(xì)胞的數(shù)量與功能，是判斷機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的重要指標(biāo) 淋巴細(xì)胞數(shù)量: 淋巴細(xì)胞亞群檢測 淋巴細(xì)胞功能: T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 細(xì)胞毒試驗(yàn) 最常見的淋巴細(xì)胞亞群包括T細(xì)胞（ CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）、B細(xì)胞、NK細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群檢測 淋巴細(xì)胞亞群檢測通過抗體組合來進(jìn)行檢測，通常用流式細(xì)胞術(shù)檢測（Flow Cytometry， FCM）。 檢測機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，且對某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等)的輔助診斷，分析發(fā)病機(jī)制，觀察療效及監(jiān)測預(yù)后有重要意義。 聯(lián)合C

15、D45三色方案：1.CD45/CD3/CD4 檢測T3細(xì)胞和T4細(xì)胞。2.CD45/CD3/CD8 檢測T3細(xì)胞和T8細(xì)胞。3.CD45/CD3/CD19 檢測T3細(xì)胞和B細(xì)胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56 檢測T3細(xì)胞和NK細(xì)胞。常用方案： 聯(lián)合CD45的四色方案： 1. CD45/CD3/CD4/CD8 檢測T3細(xì)胞和T4/T8細(xì)胞。 2. CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56 檢測T3細(xì)胞和B細(xì)胞。雙色方案：1.CD3/CD4 檢測T3細(xì)胞和T4細(xì)胞。2.CD3/CD8 檢測T3細(xì)胞和T8細(xì)胞。3.CD3/CD19 檢測T3細(xì)胞和B細(xì)胞。4.CD3/CD1

16、6和/或CD56 檢測T3細(xì)胞和NK細(xì)胞。淋巴細(xì)胞群單核巨噬細(xì)胞嗜堿性細(xì)胞粒細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測（Flow Cytometry， FCM）聯(lián)合CD45的四色方案： 1.CD45/CD3/CD4/CD8 檢測T3細(xì)胞和T4/T8細(xì)胞。 2.CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56 檢測T3細(xì)胞和B細(xì)胞或NK細(xì)胞CD45/CD3/CD4 CD45/CD3/CD8 CD45/CD3/CD19 CD45/CD3/CD16+CD56 聯(lián)合CD45的四色方案： CD4淋巴細(xì)胞減少：見于惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷病、艾滋病、應(yīng)用免疫抑制劑的患者。 CD8淋巴細(xì)胞增多：見于自身免疫病，如SLE、慢性活

17、動性肝炎、病毒感染等。 CD4/CD8比值異常：比值降低的：艾滋病患者比值顯著降低、 SLE腎病、傳染性單核細(xì)胞增多癥、急性巨細(xì)胞病毒感染、骨髓移植恢復(fù)期等。比值增高見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病等。 用于監(jiān)測器官移植的排斥反應(yīng)，若移植后CD4/CD8較移植前明顯增加，則可能發(fā)生排異反應(yīng)。臨床意義淋巴細(xì)胞功能 判斷機(jī)體細(xì)胞免疫或體液免疫功能,為了解疾病的發(fā)病機(jī)制,判斷病情與預(yù)后,觀察療效提供有價值的依據(jù) T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 細(xì)胞毒試驗(yàn) T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)3H-TdR 摻人法:人外周血T淋巴細(xì)胞在PHA刺激下發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化而增殖，處于S期的T細(xì)胞攝取胸腺嘧啶核苷（TdR）用以合成DNA。3H標(biāo)記

18、的TdR不斷地被攝入細(xì)胞內(nèi)，通過放射性計數(shù)測量方法，了解淋巴細(xì)胞增殖情況和機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。MTT 比色法:噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），是帶正電荷的化合物染料，具有細(xì)胞膜滲透性?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M(jìn)入的MTT還原為深藍(lán)色MTT-甲臜結(jié)晶，它不能穿透細(xì)胞膜，因此沉積在處于增殖且未受損傷的細(xì)胞內(nèi)。其生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，用以評估細(xì)胞存活狀況。細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶(LDH)法Na2 51CrO4能進(jìn)入到靶細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞漿蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合。當(dāng)標(biāo)記的51Cr細(xì)胞受到CTL或NK細(xì)胞損傷后，即可釋放出 51Cr，輻射射線，通過測定受損傷或死亡靶細(xì)胞釋放到上清中的 射線（51Cr），即可計算出CTL或NK細(xì)胞活性。LDH在胞質(zhì)內(nèi)含量豐富，細(xì)胞處于正常狀態(tài)下其不能通過細(xì)