1、西羅莫司高產(chǎn)突變株FC904-33黃捷金東偉余輝程元榮【摘要】西羅莫司是吸水鏈霉菌F904產(chǎn)生的新型強(qiáng)效免疫按捺劑。為了得到高產(chǎn)西羅莫司突變株，接納UV、硝苯胍和甲基磺酸乙酯誘變劑誘變處置懲罰吸水鏈霉菌F904的孢子懸液和抽芽孢子，隨后用西羅莫司對(duì)存活菌株舉行自身代謝產(chǎn)物的耐受性試驗(yàn)，得到西羅莫司高產(chǎn)突變株F904-33，其生物合本錢領(lǐng)是原動(dòng)身菌株的4.6倍。本文報(bào)道該突變株的造就特性、對(duì)抗生素的敏感性、西羅莫司消費(fèi)本領(lǐng)和副產(chǎn)物等。【關(guān)鍵詞】西羅莫司；誘變育種；生物合成ABSTRATSirlius,aperfuliunsuppressant,isprduedbyStreptyeshygrspi

2、usF904.Inanattepttiprveitsprdutin,utatinandsreeningerearriedut.SpresuspensinsandthefringbudseretreatedithUV,nitrsguanidine(NTG)andethylethanesulfnate(ES),sefsurvivrsereseletedanddetetedthEirresistanetsirlius.AutantF904-33ithhigherprdutivityfsirliusasbtainedandthefeaturesftheutantsuhasfeerby-prdutsan

3、dthesuseptibilitiestantibitisasellasitsulturalharateristiserepresented.KEYRDSSirlius;utagenesis;Bisynthesis西羅莫司(sirlius)原名雷帕霉素(rapayin)，是吸水鏈霉菌產(chǎn)生的具奇特作用機(jī)制的含氮三烯大環(huán)內(nèi)酯化合物，具有抗真菌、抗增殖和抗腫瘤活性的新型強(qiáng)效免疫按捺劑。由于其特異地結(jié)歸并按捺哺乳動(dòng)物類雷帕霉素靶卵白(analiantargetfrapayin，TR)的作用，已被用作器官移植抗排擠藥物、自身免疫性疾病治療藥1，臨床心血管支架涂料；西羅莫司及其的衍生物I-779、AP23

4、573和RAD001正開拓為靶向、低毒的抗腫瘤藥物2。在消費(fèi)歷程中，西羅莫司菌種的消費(fèi)本領(lǐng)是關(guān)鍵。本文報(bào)道應(yīng)用物理、化學(xué)誘變因子團(tuán)結(jié)誘變西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌F9043孢子懸液和抽芽孢子，存活株再行對(duì)其自身代謝產(chǎn)物西羅莫司耐藥性選擇和營養(yǎng)代謝研究，得到突變株33#以及突變株33#的造就特性、抗生素敏感性及發(fā)酵調(diào)控。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1菌種西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌(Streptyeshygrspus)F904，福建省微生物研究所保存，作為誘變育種的動(dòng)身菌株。1.2造就基及造就條件(1)瓊脂歪面造就物瓊脂歪面造就基為燕麥片瓊脂(ISP3)；自吸水鏈霉菌F904沙土保存管中取出少許保存物或自生長好的

5、瓊脂歪面取出一環(huán)造就物接種于ISP3瓊脂歪面上，28造就1520d，歪面外貌造就物出現(xiàn)吸水黑斑，4收藏備用。(2)種子造就吸水鏈霉菌F904孢子接種于種子造就基(重要身分有葡萄糖，酵母浸膏、卵白胨等，pH7.0，500l三角瓶裝80l造就基)，28、220r/in振蕩造就3648h。種子瓶外不雅濃稠，顯微鏡不雅察菌絲呈網(wǎng)狀，可作為移種的種子。(3)發(fā)酵36l的種子造就物移入60l發(fā)酵造就基中(主身分為：葡萄糖、淀粉、黃豆餅粉、卵白胨等，pH6.0，三角瓶500l)，28、220r/in振蕩造就8496h，舉行效價(jià)測(cè)定。1.3西羅莫司的檢測(cè)(1)尺度品西羅莫司尺度品由福建省微生物研究所制備，經(jīng)中

6、國藥品生物成品檢定所標(biāo)定，純度99.8%。(2)發(fā)酵液提取發(fā)酵液經(jīng)甲醇提取后2舉行生物效價(jià)測(cè)定和/或HPL檢測(cè)。(3)生物效價(jià)檢測(cè)生物效價(jià)檢測(cè)接納紙片半固體瓊脂擴(kuò)散法3。(4)HPL檢測(cè)HPL檢測(cè)接納外標(biāo)法。HPL檢測(cè)儀：BekanSysteGld，色譜柱：DS18，活動(dòng)相：甲醇水(7525)，檢測(cè)波長277n，柱溫40。西羅莫司效價(jià)=尺度品濃度樣品積分面積(tran+is)進(jìn)樣體積/尺度品積分面積(tran+is)進(jìn)樣體積1.4物理、化學(xué)誘變因子團(tuán)結(jié)處置懲罰吸水鏈霉菌F904(2)ES處置懲罰突變株27#抽芽孢子和西羅莫司抗性菌株的挑選將處置懲罰得到的突變株27#孢子接種于抽芽造就基(葡萄糖

7、1%，酵母浸膏0.6%，卵白胨0.6%，K2HP43H20.1%，gS47H20.05%，pH7.0，250l三角瓶裝30l造就基)，28，220r/in振蕩造就1820h，顯微鏡不雅察有逗號(hào)狀芽頭，10000r/in離心10in，棄上清液，網(wǎng)絡(luò)抽芽孢子，用0.1l/L、pH7.0的磷酸緩沖液洗滌，末了懸浮在含ES0.5l/L的0.1l/L、pH7.0的磷酸緩沖液中，28作用4h。5000r/in離心5in，去除含ES的清液。接納稀釋法停頓反響后，抽芽孢子移入與網(wǎng)絡(luò)抽芽孢子時(shí)等體積的上述抽芽造就基中，繼承在28振蕩造就24h。離心網(wǎng)絡(luò)菌絲體，懸浮于生理鹽水中。超聲波(型號(hào)：Siniprep15

8、0)破裂(置冰中，每次1in，隔斷30s，共15in)至菌絲出現(xiàn)較勻稱斷枝，差異稀釋度的如許處置懲罰液別離涂布于ISP3瓊脂平板和含西羅莫司350450g/l的ISP3瓊脂平板上，28造就1015d。1.5抗生素的敏感性接納固體瓊脂二倍稀釋法，造就基為ISP3瓊脂，28造就10d不雅察效果。1.63L主動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證接納美國NBSBIFLU3000發(fā)酵罐舉行。歪面孢子接入種子造就基，于28、220r/in振蕩造就3648h后以10%接種量接入發(fā)酵造就基，28、11的通宇量發(fā)酵8496h舉行西羅莫司效價(jià)檢測(cè)(HPL)。發(fā)酵歷程溶氧設(shè)置在40%，以攪拌轉(zhuǎn)速來維持設(shè)定的溶氧值，攪拌轉(zhuǎn)速操縱在100

9、400r/in之間。2效果2.1誘變處置懲罰(1)UV和NTG對(duì)吸水鏈霉菌F904的誘變處置懲罰UV照耀10s后用3g/lNTG處置懲罰吸水鏈霉菌F904孢子懸液3h，致死率達(dá)99.2%。在挑取的2050株存活株中得到70株發(fā)酵程度較動(dòng)身菌株進(jìn)步20%以上的菌株(生物檢定)，顛末進(jìn)一步挑選，得到5株發(fā)酵程度較動(dòng)身株高50%以上的菌株(HPL檢測(cè))，此中突變株27#的發(fā)酵程度約是動(dòng)身菌株的2倍。(2)ES對(duì)突變株27#的誘變處置懲罰0.5l/LES處置懲罰突變株27#的抽芽孢子，在ISP3瓊脂分散平板和含西羅莫司ISP3的瓊脂平板上別離挑取528株和242株存活株舉行挑選，效果表現(xiàn)比動(dòng)身菌株效價(jià)

10、高20%以上(生物檢測(cè))的菌株別離有21株和23株；顛末進(jìn)一步的挑選并接納HPL舉行檢測(cè)，在ISP3瓊脂平板上挑取的菌株發(fā)酵效價(jià)均不高于動(dòng)身株，而在含西羅莫司的ISP3瓊脂平板上挑取的菌株中有4株的效價(jià)較動(dòng)身菌株進(jìn)步50%。經(jīng)傳代造就，創(chuàng)造突變株33#發(fā)酵效價(jià)高(HPL檢測(cè)，表1)，組分較單一，性狀不變，生長快，孢子飽滿。2.2高產(chǎn)突變株33#的性狀研究(1)菌落形態(tài)在ISP3瓊脂平板上，與動(dòng)身菌株比擬，突變株的菌落形態(tài)產(chǎn)生顯著的變革。原動(dòng)身菌株吸水鏈霉菌F904菌落平展，粉白色，均勻直徑56，反面無色素；突變株27#菌落高起，呈圓形多皺褶，均勻直徑34，反面無色素，外貌常出現(xiàn)白色表1突變株與

11、動(dòng)身株的發(fā)酵程度比力的氣生菌絲蒙面；突變株33#菌落平展，均勻直徑56，同心圓形，反面可見淺粉赤色色素。(3)突變株33#的不變性觀察表2效果表現(xiàn)，菌株孢子瓊脂歪面保存3個(gè)月，發(fā)酵效價(jià)無顯著變革。(4)抗生素敏感性試驗(yàn)將鏈霉素、慶大霉素等抗生素應(yīng)用于大環(huán)內(nèi)酯化合物產(chǎn)生菌(特殊是西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌F904)的選育已得到必定的效果6，7。我們觀察了突變株27#和33#對(duì)差異化學(xué)類群的五種抗生素的敏感性，效果表白，效價(jià)高、副產(chǎn)物少的突變株33#對(duì)兩種氨糖抗生素的敏感度高于動(dòng)身菌株吸水鏈霉菌F904和突變株27#；對(duì)西羅莫司耐受性，突變株33#高于其他兩個(gè)動(dòng)身菌株；對(duì)絲裂霉素和利福平，與吸水鏈霉

12、菌F904和突變株27#有近似的效果(表3)。2.33L主動(dòng)發(fā)酵罐的發(fā)酵圖2表現(xiàn)突變株33#在3L主動(dòng)發(fā)酵罐的發(fā)酵參數(shù)。突變株33#糖、氮代謝正常；西羅莫司合成始于40h，發(fā)酵至88h西羅莫司合成到達(dá)最高值。在發(fā)酵過A：吸水鏈霉菌F904；B：突變株27#；：突變株33#。SRL：西羅莫司；is：順式異構(gòu)體；trans：反式異構(gòu)體表2突變株33#歪面保存時(shí)間的不變性觀察表3西羅莫司動(dòng)身菌株和突變株對(duì)抗生素的敏感度程中，隨菌絲生長，pH大幅度落落，在西羅莫司合成期維持在一個(gè)較低值，發(fā)酵后期略有上升；菌絲生恒久對(duì)氧的需求較高，攪拌轉(zhuǎn)速維持在最高設(shè)定值的400r/in，而西羅莫司合成期對(duì)氧的需求相對(duì)

13、較低，到后期維持在較低程度(200r/in擺布)。3討論關(guān)于西羅莫司菌種的選育，我們?cè)鴪?bào)道氨基糖苷類抗生素用于西羅莫司菌種選育中獲得的效果，應(yīng)用NTG處置懲罰吸水鏈霉菌F904原生質(zhì)體后在含慶大霉素1g/l的溶液中再處置懲罰得到西羅莫司合本錢領(lǐng)比吸水鏈霉菌F904高129%的突變株14-26。本文接納物理和化學(xué)誘變劑團(tuán)結(jié)處置懲罰吸水鏈霉菌F904孢子和抽芽孢子，再通過耐自身代謝產(chǎn)物西羅莫司舉行挑選得到一株較為精良的突變株33#；該菌株生物合成西羅莫司的本領(lǐng)是原始動(dòng)身菌株吸水鏈霉菌F904的4.6倍，突變株27#的2.4倍。該菌株在菌落形態(tài)等方面的性狀與前兩代菌株差異；在發(fā)酵代謝產(chǎn)物上，新菌株少

14、少合成西羅莫司發(fā)酵時(shí)常見的副產(chǎn)物洋橄欖素，使卑劣的提娶純化步調(diào)更快捷、便利；別的，新菌株的歪面孢子不變性好，F(xiàn)1代歪面在4保存3個(gè)月效價(jià)根本不變，得當(dāng)產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)的必要。以上效果在3L主動(dòng)發(fā)酵罐上得到了驗(yàn)證。產(chǎn)生菌的選育是沉重而仔細(xì)的勞動(dòng)，選擇理性和有用的育種本領(lǐng)必要舉行重復(fù)的試驗(yàn)。本報(bào)道尤其是西羅莫司產(chǎn)生菌對(duì)某些抗生素的敏感性、對(duì)自身代謝產(chǎn)物的耐受性與西羅莫司合本錢領(lǐng)的干系值得進(jìn)一步探究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1程元榮.新型強(qiáng)效免疫按捺劑雷帕霉素A.王浴生.化療藥理學(xué)與臨床研究新希望.成都：四川大學(xué)出書社，2002：2202程元榮，鄭衛(wèi).新分子靶的TR和新抗種瘤靶向藥物雷帕霉素及其衍生物J.中國處方藥，2022，(12):163程元榮，林文良，黃捷，等.新型大環(huán)內(nèi)酯免疫按捺劑西羅莫司F904的研究J.中國抗生素雜志，2002，27(12)：7094黃捷，金東偉，鄭專，等.雷帕霉素的生物效價(jià)測(cè)定J.海峽藥學(xué)，1999，11(1)：225FangA,ngGK,DeainAL.EnhaneentftheantifungalativityfrapayinbytheprduedelaiphylinandnigeriinJ.JAnbit,2000,53(2):1586hengYR,HuangJ,QiangH,etal.