1、HIV耐藥性毒株檢測方法與應用全軍艾滋病檢測中心1HIV顆粒艾滋?。篈cquired Immunodeficiency Syndroms，AIDS獲得性免疫缺陷綜合征人免疫缺陷病毒Human Immunodeficiency Virus HIV2HIV的生命周期及藥物作用靶位RNADNAHIVNucleus宿主細胞 核苷類逆轉錄酶抑制劑 (NRTIs)非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs) 蛋白酶抑制劑 (PIs)逆轉錄酶03抗HIV藥物研發(fā)和應用取得長足進展共6類34種藥物6種固定劑量藥物合劑2種進入/融合抑制劑1種整合酶抑制劑5種非核苷類逆轉錄酶抑制劑11種核苷（酸）類逆轉錄酶抑制劑9種蛋白

2、酶抑制劑4HIV的耐藥性由于HIV的基因發(fā)生突變，導致病毒對藥物的敏感性下降是抗病毒治療失敗的主要原因5耐藥性產(chǎn)生的原因 病毒自身因素 內(nèi)因 藥物的選擇壓力 外因6高復制速率重組高突變率1 substitution per genome per round7-30 crossovers per genome per round10.3x109 virions per dayHIV-1:人類最大遺傳變異的病原體7體內(nèi)的HIV是彼此不同的一群病毒,全基因組中只有很少的核苷酸是保守的，是復雜的病毒群體（準種 Quasispecies）8耐藥性產(chǎn)生：藥物選擇壓力 外因在藥物選擇壓力下，耐藥變異株完全取

3、代藥物敏感株最快發(fā)生在14 至28天內(nèi)耐藥株是在病毒自發(fā)性的、高頻率的基因突變中產(chǎn)生，在藥物選擇性的壓力下優(yōu)勢復制的結果。9HIV-1耐藥突變病毒對抗逆轉錄病毒藥物產(chǎn)生抗性病毒酶和底物的結合能力下降(PI, NRTI, NNTI, EI)磷酸化水平增加 - ATP或焦磷酸鹽可以介導切除鏈末端終止子的反應，從而破除鏈終止作用，并且可以補償性增強聚合酶的活性降低病毒復制能力增加病毒對其他抗逆轉錄病毒藥物的敏感性改變抗原表位編碼缺陷病毒10耐藥是怎樣發(fā)生的？0敏感毒株耐藥毒株藥物抑制了敏感毒株的復制耐藥株成為優(yōu)勢毒株藥物11藥物壓力時間病毒的動態(tài)和耐藥性病毒載量和復制速率12耐藥是怎樣發(fā)展的？0野生

4、毒株占優(yōu)勢耐藥毒株出現(xiàn)的早期耐藥毒株占優(yōu)勢野生毒株耐藥毒株13獲得耐藥病毒的兩種途徑 - 直接獲得: 被耐藥病毒感染- 藥物選擇: 病毒復制過程中可產(chǎn)生隨機突變，由于藥物壓力不 足，導致耐藥性突變累積14 ARTOff Rx傳播No ART耐藥性毒株的出現(xiàn)和傳播?原發(fā)耐藥：從未治療過的病人的耐藥繼發(fā)耐藥：治療后出現(xiàn)的耐藥15原發(fā)感染后耐藥毒株能持續(xù)嗎？0野生型毒株耐藥性毒株原發(fā)感染毒株6個月后分離的毒株24個月后分離的毒株16有些耐藥毒株可以持續(xù)！0野生型毒株耐藥性毒株原發(fā)感染毒株6個月后分離的毒株24個月后分離的毒株17HIV-1耐藥病毒的傳播發(fā)生率緩慢增加; 5-25% 抗逆轉錄病毒治療(

5、ART)效果降低耐藥毒株的傳播是病毒的復制適應性和獲得耐藥毒株的概率二個因素的函數(shù) 病毒的復制適應性、病毒抑制的程度以及接受治療病人危險行為的類型是影響耐藥毒株傳播的重要因素。 18復制適應性影響耐藥毒株的傳播在博茨瓦納，數(shù)學模型研究的結果即使獲得耐藥毒株的概率很高，但如果耐藥毒株的復制適應性是野生毒株的一半，到2009年，耐藥HIV毒株的流行率也達不到WHO提出的15%的警戒線水平如果耐藥毒株的復制適應性與野生毒株相同，到2009年，耐藥HIV毒株的傳播率將超過警戒限水平 19很多停止抗病毒治療的病人，由于沒有了藥物壓力，野生毒株取代耐藥毒株獲得生長優(yōu)勢，這往往伴隨著CD4細胞數(shù)的下降而抗病

6、毒治療失敗產(chǎn)生耐藥的很多病人，盡管病毒未受到有效抑制，但CD4細胞數(shù)仍高于治療前的水平可能耐藥毒株的毒力和致病性比野生型病毒低，即使產(chǎn)生了耐藥，維持耐藥毒株占優(yōu)勢對病人可能也有好處耐藥毒株的復制能力與致病特征？20耐藥毒株的流行率% of resistant isolatesSan Francisco 總醫(yī)院新感染病人中耐藥毒株的流行率021我國部分地區(qū)抗病毒治療失敗病人的耐藥譜22病毒-宿主-藥物因素對HIV-1耐藥毒株產(chǎn)生的影響 病毒: 病毒復制的水平 病毒復制能力 宿主細胞中的病毒庫 藥物: 對ART治療的遺傳屏障 吸收和排出 組織滲透性 藥物活性宿主: 服藥依從性 基因多態(tài)性：酶的等位

7、基因 CD4 & 輔助受體的水平23促使耐藥性病毒株出現(xiàn)的因素病毒載量耐藥株出現(xiàn)時間300,0000.130,00013,00010300100301,00024服藥依從性與耐藥性病毒株病毒學失敗率 (%)0204060801009590-9580-9070-80500-1000cp/ml 突變株占病毒準種的20以上 57基因型耐藥性檢測的局限性多輪PCR擴增檢測結果只出現(xiàn)一種基因型；優(yōu)勢主要的變異病毒患者體內(nèi)有上億拷貝的病毒，其中的一部分被擴增58基因型耐藥檢測結果的解釋基因型耐藥檢測報告應包括特定突變臨床意義的解釋但是:很多突變準確的臨床意義仍不清楚突變之間的相互作用使得臨床意義的估計更加

8、復雜基因型耐藥檢測結果還沒有標準的解釋不能檢測劣勢毒株 (10-20% )059表型耐藥性檢測優(yōu)點：直接定量測定耐藥性 結果容易解釋 有臨床臨界值（Cut-off） 可立即檢測對新藥的耐藥性缺點：操作復雜、價格昂貴、耗時長60傳統(tǒng)的表型耐藥性檢測方法分離培養(yǎng)HIVHIV感染性滴度測定定量HIV感染PBMC細胞，培養(yǎng)培養(yǎng)液含系列稀釋的待測藥物HIV藥物敏感毒株測定培養(yǎng)上清液的P24抗原與野毒株比較并計算IC50，61表型耐藥性檢測分離病毒在藥物存在的情況下培養(yǎng)計算IC50傳統(tǒng)方法克隆病毒RT、PR基因插入含報告基因的骨架病毒轉染細胞在藥物存在的情況下培養(yǎng)計算IC50改良方法62表型耐藥檢測檢測病

9、毒在藥物存在下的復制能力與傳統(tǒng)的細菌藥敏試驗相似結果報告為對藥物敏感性倍數(shù)的變化063+轉染蛋白酶抑制劑逆轉錄酶抑制劑感染患者體內(nèi)病毒基因片段t報告基因PRRTIN熒光素酶A-MLV env DNA耐藥表型測試載體DNA耐藥表型測試載體DNA 重組病毒法進行 表型檢測(ViroLogic PhenoSense)價格Costs $1000/標本檢測的重組病毒由患者的pol基因，帶有報告基因（熒光素酶）并且env基因缺陷的HIV標準病毒構建重組病毒與雙嗜性的鼠白血病病毒（MLV）共轉染檢測假病毒顆粒對不同稀釋度藥物的敏感性攜帶患者pol基因重組病毒IC50 或IC95值 與標準病毒進行比較64表型

10、耐藥性檢測方法藥物濃度病毒抑制率 (%)野生型病毒耐藥株1000IC50, WTIC50, MT50耐藥倍數(shù)IC50 = 50% 抑制濃度結果表達方式:病毒的50%抑制濃度(IC50)及其與野毒株相比增加的倍數(shù)65IC50增加的倍數(shù)是耐藥程度的度量藥物IC50增加倍數(shù)ZAT 4.03TC 48.1 NVP 1.4DDI 1.4IDV 10倍=高度耐藥） 生物學 - 超過未治療患者體內(nèi)分離病毒藥物抑制濃度的范圍臨床 - 倍數(shù)與臨床研究中的病毒復制抑制失敗相關673TC耐藥株誘導及基因型和表型耐藥性檢測傳代數(shù)每代培養(yǎng)天數(shù)藥物濃度(M)每代IC50 (M)Pol區(qū)184密碼子184編碼的氨基酸IC5

11、0倍數(shù)變化00.018bATGMd150.008NDcND250.016NDND350.0320.026ATGM1.4450.064NDND560.1280.15ND8.3660.2560.15ATGM8.3760.5122048ATAIe113777.8861.024NDND972.048NDATAI1074.0962048ATAI113777.868PhenoSense HIV Report069虛擬表型（Virtual Phenotype）基因型ProteaseRTHIV數(shù)據(jù)庫Genotype & Phenotype Data虛擬表型Wild-type HIVResistant HIV0

12、70普遍性抗病毒治療2012年7月美國健康和人類服務部更新了成人AIDS抗病毒治療指南，推薦不論CD4細胞計數(shù)多少，所有HIV/AIDS患者都應進行治療，將治療作為預防的手段之一。2012年7月16日，美國FDA批準Truvada（emtricitabine/tenofovir合劑）用于高危人群HIV暴露前的預防2012年7月22日27日在美國召開的第19屆世界艾滋病大會提出了終止AIDS流行的遠景71毋庸置疑，抗病毒藥物的研發(fā)和應用在防治AIDS中取得了顯著的成效。但同時，與抗生素在人和動物中廣泛使用或濫用導致耐藥細菌的類型和數(shù)量快速增加一樣，抗病毒藥物的快速推廣應用，導致耐藥HIV毒株的出

13、現(xiàn)和傳播，不僅影響著抗病毒治療的效果，導致治療失敗，增加艾滋病相關的死亡，還可能快速消耗有限的藥物資源，不利于AIDS防治的長期可持續(xù)發(fā)展?？共《舅幬镞€作為一種人為施加的廣泛存在的選擇壓力，深刻影響著病毒的整體變異和進化72由于HIV及其準種的高度變異性、藥物種類及其作用機制的多樣性，以及基因型和表型檢測方法的復雜性，目前，將HIV耐藥檢測結果整合入臨床常規(guī)治療的管理還存在很大問題，耐藥檢測還未能象其他臨床檢驗一樣與治療有機地結合在一起，制訂合理的臨床應用指南是耐藥檢測面臨的最大挑戰(zhàn)732012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南耐藥檢測方法的選擇目前尚無確定的研究支持哪種耐藥檢測方法更佳多數(shù)情

14、況下推薦使用基因型檢測，因其相對操作簡便、省時、花費少，在野生毒株與耐藥毒株混合存在的情況下具有較高的敏感性如果懷疑有整合酶抑制劑及進入/融合抑制劑的耐藥HIV毒株，應將擴增測序的區(qū)域擴展至病毒的整合酶區(qū)和膜區(qū)對有復雜治療史、懷疑存在復雜耐藥突變型的患者，可考慮做表型耐藥檢測742012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南 耐藥檢測對象所有進入醫(yī)學觀察的HIV感染者和AIDS患者，不論是否進行抗病毒治療，都應進行基因型耐藥檢測752012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南初始抗病毒治療患者 應進行耐藥檢測，以指導并制定抗病毒治療方案耐藥毒株能夠傳播并與初始抗病毒治療的病毒學應答不理想有關從未經(jīng)歷

15、過治療的患者也可能攜帶耐藥毒株對這類患者進行耐藥檢測有助于選擇能夠取得最大病毒抑制效果的治療762012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南接受抗病毒治療的患者 在改變抗病毒治療方案時、病毒學失敗時（HIV RNA1000 copies/ml）及病毒抑制不理想時都應進行耐藥檢測，以判斷是否發(fā)生耐藥以及對哪種藥物耐藥，從而指導選擇有活性的抗HIV藥物后續(xù)治療研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥檢測結果指導下制訂的抗病毒治療方案與只根據(jù)臨床判斷制訂的治療方案相比，前者病毒學應答的提高和改善更為顯著對于HIV RNA為5001000 copies/ml的患者，檢測的難度比較大，但仍應盡量做；對500 copies/ml的

16、患者則不建議做772012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南急性HIV感染者 應進行基線耐藥檢測，以指導選擇能夠取得最理想的病毒學應答效果的方案，且首選基因型方法如治療，不必等待耐藥檢測結果出來后再服藥，拿到檢測結果后，如治療方案不合適再進行調(diào)整如不治療，仍推薦進行耐藥檢測，以確定是否為耐藥HIV毒株的原發(fā)感染在不治療的情況下，耐藥毒株可能隨著時間減少至檢測限下，一旦開始治療將增加治療失敗的風險。因此，急性期不治療也應進行耐藥檢測并記錄結果，為以后的治療提供重要參考782012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南慢性HIV感染者 是否應進行耐藥檢測，目前意見不一致。因尚不清楚傳播獲得的耐藥毒株回

17、復成為野生毒株可能性有多大傳播的耐藥突變一般比藥物選擇出的突變更為穩(wěn)定，有研究報道在慢性感染者中檢測到幾年以前傳播獲得的耐藥HIV毒株已有數(shù)據(jù)顯示基線的耐藥突變與治療應答的不理想相關推薦對慢性感染者進入臨床觀察時進行耐藥檢測792012年，美國成人AIDS抗病毒治療指南孕婦開始抗病毒治療前都應做基因型耐藥檢測抗病毒治療的目的是最大程度降低血漿病毒載量并預防HIV母嬰傳播，首要目的是取得最大程度的病毒抑制孕婦開始抗病毒治療前都應進行基因型耐藥檢測，對已接受治療而HIV RNA仍能夠檢出的孕婦也應進行檢測80HIV-1耐藥性檢測的時機選擇 抗病毒治療失敗需要進行耐藥性檢測時，應該在病人仍在服藥時或

18、停藥后立即（4周內(nèi)）進行檢測 不推薦對病毒載量1000cp/ml的病人做病毒載量檢測，因為病毒水平太低很難擴增出目的基因片段81依據(jù)耐藥結果決定抗逆轉錄病毒治療的策略藥物效價以及其他藥物因素服藥依從性和其他患者因素考慮病毒因素和免疫狀態(tài)考慮患者體內(nèi)病毒的總體耐藥情況考慮患者體內(nèi)病毒的總體耐藥情況基于測序結果制定治療方案預留一類或以上的藥物為以后的治療作準備將初始方案治療失敗的風險降到最低將后續(xù)方案治療成功的機率增加到最大82HIV-1的耐藥性不是全或無的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測結果解釋的困難,需要將體外和體內(nèi)的資料結合起來分析： 所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性 藥物即使有耐藥性也可能有益處，因為有耐藥性突變的病毒比敏感毒株的復制適應性要差得多 血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平的蛋白酶耐藥性有時能夠被克服83抗病毒治療失敗的原因很多，包括藥物的抗病毒活性不足、服藥依從性差及個體藥物代謝動力學差異等，耐藥只是治療失敗的可能原因之一，并且與其他導致治療失敗的因素密切相關因此不能孤立地看待耐藥檢測結果，而應將其放在病毒載量和CD4細胞計數(shù)的變化、