1、超高分辨率熒光顯微成像技術(shù)-第三小組2015.11.05STED（受激發(fā)射損耗熒光顯微術(shù)）傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的衍射極限是/2突破光學(xué)衍射極限的方法之一是近場光學(xué)顯微鏡，其缺點是只能觀測到細胞的表面信息STED熒光顯微術(shù)是一種遠場光學(xué)顯微術(shù)，能夠觀察到細胞的三維立體結(jié)構(gòu)基本原理好比用一直很粗的鉛筆畫細線：先畫好粗線，再用橡皮擦去周邊多余的部分我們在成像技術(shù)中所選擇的激發(fā)光就是一直很粗的鉛筆，相對應(yīng)的損耗光是橡皮擦，利用損耗光擦去發(fā)光點周圍的熒光強度從而減小熒光點的半徑，提高分辨率激發(fā)光損耗光熒光物質(zhì)發(fā)生受激輻射能級上的粒子數(shù)被消耗（粒子回到激發(fā)態(tài)）STED的原理涉及激光的非線性抑制機制。類似BOSE

2、降噪耳機，STED也是主動發(fā)射一 環(huán)形的“抑制激光”(相位和激發(fā)激光差180 度)，把本來存在在四周的熒光信號強行拉回到基態(tài)，但不產(chǎn)生光子。這樣一來，本來一個很大的光斑就剩下中心區(qū)域一個5060nm的光斑，已經(jīng)大大突破了衍射極限。Stefan Hell第一次 實現(xiàn)了超高分辨的光學(xué)顯微技術(shù)。 STED缺點：耗損光需要很強的亮度，激光器造價昂貴，對樣品損傷較大，操作起來相當繁瑣， 一次只能看一塊很小很小的區(qū)域，效率低。遠不如現(xiàn)在用的PALM或STORM。注意事項及缺點激發(fā)光及損耗光的時間差及波長差要合適，保證先激發(fā)后損耗，即激發(fā)又損耗需要使用強光，能量利用率低過強的光容易引起光漂白成本偏貴適用范圍

3、窄SSIM：Saturated Structured Illumination Microscopy， 飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡 緊隨STED (受激發(fā)射損耗)這項開創(chuàng)性工作 之后，世界各地實驗室研究機構(gòu)陸續(xù)出現(xiàn) 了一批高分辨率的顯微鏡技術(shù)。例如，由 珍妮莉婭法姆研究學(xué)院的物理學(xué)家兼工程 師麥茨古塔弗森 (Mats Gustafsson) 領(lǐng)導(dǎo)的 研究團隊開發(fā)出了結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡 (structuredillumination microscopy, SIM ) 。 利用莫爾條紋原理，將柵欄狀的光條紋重 疊，產(chǎn)生衍射圖像，再利用數(shù)學(xué)的方法把 衍射圖像還原成真實的圖像。SSIM改變光學(xué)的點擴散函數(shù)來

4、突破光學(xué)極限的另一個方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM) SSIM技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息.莫爾條紋是一種常見的光學(xué)現(xiàn)象，只要把周期性 的條狀圖案重疊就可以觀察到。莫爾條紋是18世紀法國研究人員莫爾先生首先發(fā)現(xiàn)的一種光學(xué)現(xiàn)象。從技術(shù)角度上講，莫爾條紋是兩條線或兩個物體之間以恒定的角度和頻率發(fā)生干涉的視覺結(jié)果，當人眼無法分辨這兩條線或兩個物體時，只能看到干涉的花紋，這種光學(xué)現(xiàn)象中的花紋就是莫爾條紋。莫爾條紋能從三個方面產(chǎn)生：1. 雙色或多色網(wǎng)點

5、之間的干涉；2. 各色網(wǎng)點與絲網(wǎng)網(wǎng)絲之間的干涉；3. 作為附加的因素，由于承印物體本身的特性而發(fā)生的干涉。使用莫爾條紋防護系統(tǒng)的目的就在于根據(jù)你選定的絲網(wǎng)目數(shù)、加網(wǎng)線數(shù)、印刷色數(shù)和加網(wǎng)角度來預(yù)測莫爾條紋。莫爾條紋以透射光柵為例，當指示光柵上的線紋和標尺光柵上的線紋之間形成一個小角度，并且兩個光柵尺刻面相對平行放置時，在光源的照射下，位于幾乎垂直的柵紋上，形成明暗相間的條紋。這種條紋稱為“莫爾條紋” 。如果知道b的結(jié)構(gòu)及a+b所疊加的莫爾條紋c，將不能探測的高頻轉(zhuǎn) 化為能探測的低頻，就能夠反推出a所攜帶的精細結(jié)構(gòu)信息。 即使a、b圖逐漸縮小， 里面的高頻條紋已經(jīng)不可見了，但是在c中的莫爾條紋仍可

6、以清楚地分辨，這就是 SIM的精義。結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（SIM） 基于結(jié)構(gòu)照明原理的超高分辨率技術(shù)是美國科學(xué)家麥茨古塔弗森 (Mats Gustafsson) 在2000年發(fā)明的，非常適于細胞研究，分辨率提高了一倍。這個技術(shù)基于兩個高 空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過解析莫爾條紋實現(xiàn)超 高分辨率成像。單分子熒光定位超分辨顯微成像技術(shù)熒光顯微成像的極限顯微鏡的分辨率定義為顯微鏡可以分辨出來的兩個同等亮度的點光源之間的最小距離顯微鏡分辨率的極限是由光的衍射特性決定的點光源經(jīng)過透鏡組及物鏡后在焦平面上形成模糊的光斑光斑大小是入射光的波長，n是介質(zhì)的折射系數(shù)，是物鏡的半孔徑角度，而NA

7、則是物鏡的數(shù)值孔徑 對比度分辨率不僅與半高寬有關(guān)而且與成像的對比度有關(guān)對比度：在兩個同樣亮度的點光源光斑中間存在亮度的最小值，而點光源光斑中心為亮度的最大值，兩值之差與亮度最大值得比值即為對比度。通過重復(fù)掃描目標樣本，并在每次拍攝時只讓少量分子發(fā)光，最后把 所得圖像重迭在 起 得到突破“衍射極限 的高分辨率 微影像 所得圖像重迭在一起，得到突破“衍射極限”的高分辨率顯微影像。 Eric Betzig PALM Betzig 莊小威 STORM 2006年，超高分辨率顯微鏡研究翻開了新的篇章。Eric Betzig、 莊曉威科研小組幾乎同時報道了他們提高顯微鏡分辨率 的科研成果。貝齊格(Betz

8、ig)的PALM技術(shù)與莊小威的STORM技術(shù)雖然叫法不同，但都是利用 了熒光分子的可調(diào)控性原理 ,論文也是在2006年差不多的時間發(fā)表 。PALM綠色熒光蛋白（GFP)的變種（PA-GFP)特性：在未激活之前不發(fā)光，用405nm的激光激活一段時間后才可以觀察到488nm激光激發(fā)出來的綠色熒光利用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性可以突破光學(xué)分辨率的極限PALM用PA-GFP來標記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)405nm激光器的能量，低能量照射細胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用488nm激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子在確定這些分子的位置后，再長時間使用

9、488nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來之后，分別用405nm和488nm激光來激活和漂白其他的熒光分子，進入下一次循環(huán)這個循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微技術(shù) PALM的不足PALM的成像方法只能用來觀察外源表達的蛋白質(zhì)，而對于分辨細胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力 STORM基本原理傳統(tǒng)成像由于分子同時受激發(fā)，同時發(fā)光，導(dǎo)致艾里斑互相重合，無法分辨單個分子。 STORM成像，每次樣品中僅有少量隨機、離散的單個熒光分子發(fā)光。由于距離較遠，

10、 艾里斑不會互相重合 通過標記中心可以識別單個熒光分子；通過擬合，找出每個熒 光分子中心點的位置。重復(fù)拍攝多張照片之后，就可以把所有熒光分子的中心點位置 疊加起來形成整幅圖像。STORM的優(yōu)勢STORM也可以實現(xiàn)延時拍攝。(1.線粒體的融合和分裂過程。由于STORM成像的分辨率很高，所以可以進行定性 以及精確的定量統(tǒng)計。比如線粒體的寬度等。2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化過程。非常直觀地看到ER tubule的伸長過程。)STORM 還能實現(xiàn)多色標記。(science上發(fā)表文章，利用 電鏡技術(shù)，確實可以看到ER tubule為線粒體的分裂標記了 位置。)STORM的不足由于用抗體來標記內(nèi)源蛋白

11、并非一對一的關(guān)系，所以STORM不能量化胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的數(shù)量，同時也不能用于活細胞測量 Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM)Providing us with eyes for the nanoworldThe Original Idea of NSOM Schematic representation of Synges idea for achieving subdiffraction limit spatial resolution. Incident radiation is passed through a small, subw

12、avelength hole in an opaque screen. By the positioning of the screen close to the sample, the emerging radiation is forced to interact with the sample before diffracting out. The evanescent field from the aperturedecays rapidly, illuminating only the near-field.Comparison of far-field and near-field

13、 imaging of a sample Far-field imaging: the light source or light-collecting element is separated from the sample by a distance, h, the wavelength of light used for illumination. Light is diffracted so that the area illuminated isthan the aperture. Sub details of the image are lost. Near-field imagi

14、ng: the optics are separated from the sample by a distance, h. The area illuminated corresponds well with the aperture of the optics.Basic Concept of NSOM Near-field microscopes circumvent the diffraction barrier by exploiting the unique properties of evanescent waves. In practice, the nanosized det

15、ector aperture is placed adjacent to the specimen at a distance much shorter than the illumination wavelength (giving rise to the term near-field) to detect non-propagating light waves generated at the surface.The Greatest Advantage of NSOM Resolution is limited only by the physical size of the aper

16、ture rather than the wavelength of illuminating light, such that lateral and axial resolutions of 20 nanometers and 2 to 5 nanometers, respectively, can be achieved.The Disadvantages of NSOMVery low working distance and extremely shallow depth of field.Limited to study surfaces.Not conducive for studying soft materials, especially under shear force mode.Long scan times for large sample areas for high resolution imaging.Problems Restricting the Use of NSOM in BiologyProvision of adequate lightFormation of small aperturesControl of p