1、第十章 中藥制劑分析中新方法與新技術(shù) 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)頂空氣相色譜法（液上氣相色譜法、頂空分析法） 對(duì)樣品基質(zhì)上方的氣體成分進(jìn)行GC分析來測(cè)定這些組分在原樣品中的含量頂空氣相色譜的分類靜態(tài)頂空GC動(dòng)態(tài)頂空GC 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)頂空氣相色譜法主要特點(diǎn)樣品前處理簡(jiǎn)單檢測(cè)限低可分析含量低、組成復(fù)雜的樣品適用于易揮發(fā)或易分解或無法直接進(jìn)樣分析的液體或固體樣品的分析 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)頂空氣相色譜法應(yīng)用實(shí)例靜態(tài)頂空GC(內(nèi)標(biāo)法)測(cè)定血液中乙醇含量對(duì)照品溶液的制備 將10g/l的乙醇儲(chǔ)備液稀釋10倍，精密吸取此液1ml置于10ml頂空樣品瓶中，同時(shí)精密加1ml內(nèi)標(biāo)溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，

2、即得。樣品制備 精密吸取1ml充分混勻的血樣轉(zhuǎn)移至10ml頂空樣品瓶中，同時(shí)精密加1ml內(nèi)標(biāo)溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，即得。 色譜條件 （略）頂空分析條件 平衡溫度為50，平衡時(shí)間為10分鐘（快速攪拌下），閥、輸送管及定量管溫度為80，加壓為13.8kPa，加壓時(shí)間、充樣時(shí)間和壓力平衡時(shí)間均為0.15分鐘，定量管為1.0ml。 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)超高效液相色譜（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）主要特點(diǎn)固定相雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團(tuán)顆粒粒度小，僅為1.7m耐壓，顆粒度分布范圍很窄裝柱檢測(cè)器響應(yīng)快樣品池1

3、0mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一） 優(yōu)點(diǎn)更高的分析速度，更好分離效果和更高的靈敏度，速度、靈敏度及分離度，分別是HPLC的9倍、 1.7倍及3倍 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)超臨界流體色譜（SFC, supercritical fluid chromatography）以超臨界流體（低黏度、高密度以及較高的擴(kuò)散系數(shù)）作為流動(dòng)相。對(duì)GC及HPLC的檢測(cè)器均可兼容使用適用于分析GC難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)性樣品分離速度較HPLC，分離效果更好。應(yīng)用實(shí)例超臨界流體色譜法測(cè)定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)色譜聯(lián)用技術(shù)多維色譜如：二維薄層色譜等氣相色譜-

4、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 2 高效毛細(xì)管電泳(HPCE,high performance capillary electrophoresis)電泳: 在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。 由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。1937年 Tiselius (瑞典) 利用自由溶液電泳將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白1981年 Jorgenson 和 Luckas 發(fā)展了高效毛細(xì)管電泳分離分析技術(shù) (使用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管和采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓)， 2

5、高效毛細(xì)管電泳 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + =電滲流 + +ef 陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致 - =電滲流 - -ef 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反 0 =電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致 可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離分離原理 電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。 2 高效毛細(xì)管電泳儀器裝置電壓：030KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可檢測(cè)到：10-1910-21mol/L 2 高效毛細(xì)管電泳主要特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)

6、分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液 2 高效毛細(xì)管電泳常見的毛細(xì)管電泳模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)（膠束作為假固定相的電動(dòng)色譜）毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)（凝膠作為支持物，起分子篩的作用）毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF)（用于蛋白質(zhì)、多肽等兩性物質(zhì)的分離）毛細(xì)管等速電泳(CITP) 2 高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用離子分析藥物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA測(cè)序HPCE在中藥制劑分析中的應(yīng)用生物堿的測(cè)定、動(dòng)物類藥材的鑒別、指紋圖譜高效毛細(xì)

7、管電泳法測(cè)定心舒口服液中腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量對(duì)照品溶液 （略）供試品溶液的配制取心舒口服液10 mL，加熱濃縮至約1 mL，加60 %甲醇定容10 mL，冰箱放置過夜，經(jīng)0. 45 mm濾膜濾過備用。電泳條件以熔融石英毛細(xì)管( 50 mm 66 . 5 cm，有效分離長(zhǎng)度58 cm) 為分離通道，以105 mmol/L硼砂液為運(yùn)行緩沖液，壓力進(jìn)樣50 mpa，6 s，毛細(xì)管柱溫度為20 ，運(yùn)行電壓為0 30 min : 24 kV，30 60 min : 28 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，毛細(xì)管柱使用前以0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液、注射用水和運(yùn)行緩沖液依次沖洗5 ,5 ,8 min

8、，每次電泳后以運(yùn)行緩沖液沖洗8 min 。在此條件下，同時(shí)測(cè)定腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量。（隋印等. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志. 2019, 25(3):232-234） 3 原子吸收光譜（AAS,atom absorption spectrometry）工作原理1）各種元素的原子結(jié)構(gòu)和外層電子排布不同， 基態(tài)第一激發(fā)態(tài): 躍遷吸收能量不同具有特征性 2）各種元素的基態(tài)第一激發(fā)態(tài) 最易發(fā)生，吸收最強(qiáng)，最靈敏線。特征譜線(共振線)。 3）利用待測(cè)元素的原子蒸氣中基態(tài)原子與共振線吸收之間的關(guān)系來定量分析。 3 原子吸收光譜工作原理 3 原子吸收光譜原子吸收光譜儀銳線光源空心陰極燈 3 原子吸收光譜原子吸收光

9、譜儀原子化系統(tǒng)將試樣中離子轉(zhuǎn)變成原子蒸氣。原子化方法火焰法無火焰法電熱高溫石墨管，激光冷原子化法單色器（色散元件（棱鏡、光柵），凹凸鏡、狹縫等）檢測(cè)系統(tǒng)（光電池、光電倍增管、光敏晶體管） 3 原子吸收光譜優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：原子化程度高，試樣用量少（1100L），可測(cè)固體及粘稠試樣，靈敏度高，檢測(cè)限10-12 g/L。缺點(diǎn)：精密度差，測(cè)定速度慢，操作不夠簡(jiǎn)便，裝置復(fù)雜。 4 中藥指紋圖譜 從整體上評(píng)價(jià)中藥的內(nèi)在質(zhì)量中藥指紋圖譜建立的原則盡可能多的覆蓋全貌特征明顯，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好方便操作與應(yīng)用 4 中藥指紋圖譜中藥（化學(xué)）指紋圖譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立中藥材的選擇 選用經(jīng)品種鑒定的正品優(yōu)質(zhì)地道藥材，確定

10、圖譜的特征參數(shù)。另收集多產(chǎn)地，具充分代表性，符合藥用規(guī)格的樣品，對(duì)圖譜特征的重現(xiàn)性進(jìn)行考查。隨之收集一些易混淆或曾出現(xiàn)的偽品，以所確定的特征若能加以區(qū)別和辨認(rèn)，則更為理想。實(shí)驗(yàn)樣品的制備 可根據(jù)藥材所含成分選定，盡可能考慮對(duì)不同成分的兼容性，通常用不同極性的溶劑23種，制成供試品，供一組圖譜綜合鑒定應(yīng)用。 注意取樣代表性與均勻性。 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立檢測(cè)方法現(xiàn)代光譜（紅外光譜，紫外光譜）色譜（氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳）其它（X光衍射） 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜鑒別指紋圖譜的解析研究指紋圖譜中特征信號(hào)的歸屬各指紋圖譜的相關(guān)性研究直觀比較相對(duì)指數(shù)

11、、重疊率、八強(qiáng)峰等量化數(shù)據(jù)計(jì)算機(jī)輔助中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件 4 中藥指紋圖譜酸醇提取液中紫外吸收成分的HPLC 分析（=254 nm）二甲亞砜提取液中可見吸收成分的HPLC 分析（=451 nm）體外培育牛黃與天然牛黃指紋圖譜的比較研究(丁崗等. 中國(guó)天然藥物, 2019,2(5)309-312）5 其他技術(shù) 用生物檢定法來評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量例1：用生化指標(biāo)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量與藥效相關(guān)性更 為密切，以淀粉酶活力比較測(cè)定雞內(nèi)金、 鴿內(nèi)金、鵪鶉內(nèi)金的比活力，提出了量化 數(shù)據(jù)。例2：利用大蒜提取物中大蒜辣素和大蒜新素具 有抗菌作用這一特點(diǎn)，用生物檢定方法進(jìn) 行檢測(cè)，結(jié)果與氣相色譜法測(cè)定結(jié)果一致。5 其他技術(shù) DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù) DNA分子-遺傳信息的直接載體， 物種鑒別更為準(zhǔn)確可靠 90年代，PCR (Polymorase Chain Reaction)