1、本課程內(nèi)容第一章 緒論第二章 基因克隆的工具酶第三章 基因工程的載體第四章 目的基因的制備第五章 目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章 外源基因的表達(dá)第七章 基因操作的基本技術(shù)第八章 植物基因工程及應(yīng)用第九章 動(dòng)物基因工程及應(yīng)用第十章 醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用9/24/20221歡迎同學(xué)們聽課！第六章 外源基因的表達(dá)第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)第二節(jié) E. coli 重組蛋白的限制因素第三節(jié) 真核生物表達(dá)系統(tǒng)9/24/20222歡迎同學(xué)們聽課！引言生物技術(shù)的應(yīng)用可以追溯到4000年前，新石器時(shí)代的晚期，利用發(fā)酵過程生產(chǎn)蜂蜜酒。20世紀(jì)，隨著一系列的微生物在工業(yè)上的應(yīng)用，生物技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展。1927年，

2、Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)Penicillium能夠合成青霉素。隨后，真菌和細(xì)菌被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)抗生素。許多重要的醫(yī)藥，并不是來自于微生物，而是高等生物產(chǎn)生的?；蚬こ痰膽?yīng)用，帶來了生物技術(shù)的革命?；蚬こ桃馕吨匾闹参锘騽?dòng)物蛋白基因可以從宿主中分離出來，插入載體，引進(jìn)細(xì)菌獲得大量蛋白。9/24/20223歡迎同學(xué)們聽課！外源基因表達(dá)體系：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。有基因表達(dá)載體和受體細(xì)胞兩部分組成。原核基因表達(dá)系統(tǒng)和真核基因表達(dá)系統(tǒng)。9/24/20224歡迎同學(xué)們聽課！原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞的特點(diǎn)

3、：單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易控制?；蚪M結(jié)構(gòu)簡單，基因操作和分析容易。含有質(zhì)粒或噬菌體，易于構(gòu)建表達(dá)載體。生理代謝途徑及基因表達(dá)控制機(jī)制比較清楚。無真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)。有內(nèi)源蛋白酶9/24/20225歡迎同學(xué)們聽課！mRNA的延伸與穩(wěn)定性防止非特異性終止： 避免衰減子；加入抗終止的序列元件。轉(zhuǎn)錄終止序列： 保證轉(zhuǎn)錄正常終止，防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄終止產(chǎn)物，使mRNA的長度限制在一定范圍內(nèi)，增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。Poly(A)摻入信號(hào)序列9/24/20227歡迎同學(xué)們聽課！表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性：防止表達(dá)產(chǎn)物被內(nèi)源蛋白水解酶水解 途徑： a. 構(gòu)建融合蛋白表達(dá)體系 b. 構(gòu)建分泌蛋白表

4、達(dá)體系 c. 構(gòu)建包涵體表達(dá)體系 d. 選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)9/24/20228歡迎同學(xué)們聽課！第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌基因表達(dá)載體的重要組成元件：啟動(dòng)子：Lac和Tac；PL和PR；T7核糖體結(jié)合位點(diǎn)插入位點(diǎn)終止子復(fù)制起始區(qū)選擇標(biāo)記9/24/202210歡迎同學(xué)們聽課！外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式：包涵體、融合蛋白和分泌蛋白寡聚型外源蛋白： a. 多表達(dá)單元的串聯(lián)重組 b. 多順反子重組 c. 多密碼序列重組整合型外源蛋白：將外源基因整合到宿主染色體非必需編碼區(qū)，在合適的條件下高效表達(dá)。9/24/202211歡迎同學(xué)們聽課！融合蛋白、分泌蛋白和包涵體融合蛋白(fusi

5、on protein)：將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，沒有改變兩個(gè)基因的閱讀框，以這種形式表達(dá)的蛋白，稱為融合蛋白。分泌型蛋白(secreted protein)：外源基因的表達(dá)產(chǎn)物N端連有一信號(hào)肽序列，通過運(yùn)輸和分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。包涵體(inclusion body)：一定條件下，外源基因表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。9/24/202212歡迎同學(xué)們聽課！3） 核糖體結(jié)合位點(diǎn)：能被核糖體識(shí)別的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄成mRNA分子后，核糖體在這一位點(diǎn)上結(jié)合。高等生物的基因也被表達(dá)信號(hào)所包圍，但他們的核苷酸序列與E. coli的

6、并不相同。比較E. coli和人類的啟動(dòng)子，有一些是相同的，但是E. coli的RNA聚合酶不可能結(jié)合到人類的啟動(dòng)子上，細(xì)菌不能識(shí)別人類基因的表達(dá)信號(hào)。9/24/202214歡迎同學(xué)們聽課！基因表達(dá)的信號(hào)9/24/202215歡迎同學(xué)們聽課！表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)9/24/202217歡迎同學(xué)們聽課！（一） 啟動(dòng)子啟動(dòng)子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，這是因?yàn)閱?dòng)子控制了基因表達(dá)的第一個(gè)階段，決定了mRNA合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子： 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 組成型啟動(dòng)子調(diào)控元件9/24/202218歡迎同學(xué)們聽課！真核與原核生物啟動(dòng)子的差異 9/24/20221

7、9歡迎同學(xué)們聽課！a) 啟動(dòng)子的選擇所有E. coli啟動(dòng)子都有兩個(gè)保守序列，保守序列的變化是影響轉(zhuǎn)錄效率的主要因素。強(qiáng)啟動(dòng)子可以啟動(dòng)高效率的表達(dá)，合成大量表達(dá)產(chǎn)物。相反，弱啟動(dòng)子，在細(xì)胞中表達(dá)量較低。表達(dá)載體應(yīng)該含有強(qiáng)啟動(dòng)子，這樣克隆的基因可以以最高的速度表達(dá)。建立表達(dá)載體的另一個(gè)需要考慮的因素是啟動(dòng)子的調(diào)控，主要有兩種調(diào)控方式：誘導(dǎo)：一個(gè)誘導(dǎo)的基因是在加入底物后基因的表達(dá)才能啟動(dòng)抑制：可抑制的基因是在加入調(diào)控物后表達(dá)被關(guān)閉。9/24/202220歡迎同學(xué)們聽課！大腸桿菌基因表達(dá)的調(diào)控方式 9/24/202221歡迎同學(xué)們聽課！基因調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，啟動(dòng)子的參與僅僅是間接的。許多參與誘導(dǎo)

8、和抑制的序列存在于啟動(dòng)子的周圍。所以誘導(dǎo)和抑制啟動(dòng)子的化學(xué)試劑也同樣調(diào)控克隆基因的表達(dá)。如果重組蛋白對細(xì)菌有害，其合成必須嚴(yán)格控制在毒性的水平之下。可以利用調(diào)控物抑制基因的表達(dá)。即使重組蛋白對寄主細(xì)胞無害，仍然需要調(diào)控克隆基因的表達(dá)，因?yàn)槌掷m(xù)的高水平表達(dá)可以影響重組質(zhì)粒的復(fù)制，最終導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的下降。b) 表達(dá)載體應(yīng)用的啟動(dòng)子幾種使用頻率最高的啟動(dòng)子：9/24/202222歡迎同學(xué)們聽課！突變體所產(chǎn)生的cI蛋白可以抑制 PL啟動(dòng)子，在較高的溫度下，蛋白失活可以導(dǎo)致克隆基因的轉(zhuǎn)錄。（二）Cassettes和基因融合一個(gè)高效的表達(dá)載體不僅需要可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，而且需要E. coli核糖體的結(jié)合位點(diǎn)

9、序列和終止子。在載體中，這些表達(dá)信號(hào)組成一個(gè)cassette。某些casstte載體，克隆的基因并不是直接的與核糖體結(jié)合位點(diǎn)臨近，而是在一段E. coli基因之后，E. coli的基因直接與結(jié)合位點(diǎn)相鄰。外源基因的插入必須能夠融合兩個(gè)閱讀框架的方式進(jìn)行，這樣就產(chǎn)生了雜交的基因。因此基因的表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)蛋白質(zhì)的雜交9/24/202224歡迎同學(xué)們聽課！分子，包含E. coli閱讀框架編碼的短肽和外源基因蛋白，這樣一個(gè)融合的系統(tǒng)具有四種優(yōu)點(diǎn)：1) 克隆基因的mRNA的高效翻譯不僅依賴于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在，而且受編碼起始的核苷酸序列的影響。這可能是鏈間配對形成的次級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響核糖體與其結(jié)合位點(diǎn)的

10、結(jié)合。如果相關(guān)的序列是由E. coli序列組成，可以避免這一可能性。2) 在融合蛋白中存在細(xì)菌肽可以穩(wěn)定分子阻止被寄主細(xì)胞降解。3) 細(xì)菌片段可能含有信號(hào)肽，引導(dǎo)重組蛋白運(yùn)輸?shù)桨?。如ompA或者malE基因，這樣重組蛋白可以9/24/202225歡迎同學(xué)們聽課！利用CNBr將融合蛋白從蛋氨酸處切下 9/24/202227歡迎同學(xué)們聽課！第二節(jié) E. coli 重組蛋白的限制因素在E. coli中生產(chǎn)蛋白仍然存在許多問題，這些問題可以分為兩大類：一是因?yàn)橥庠椿虻男蛄?；二是因?yàn)樵贓. coli合成重組蛋白存在限制。一、外源基因序列導(dǎo)致的問題有三種方式可能導(dǎo)致核苷酸序列阻止外源基因在E. col

11、i中的高效表達(dá)：1） 外源基因可能含有內(nèi)元。E. coli缺乏切除內(nèi)元的機(jī)制。2） 外源基因可能含有在E. coli作為終止子的序列。3） 基因的密碼子可能不適合于E. coli中翻譯。9/24/202228歡迎同學(xué)們聽課！總體上講，所有的生物都共用相同的密碼子，但每一種生物都有偏愛的密碼子，表現(xiàn)在tRNA識(shí)別不同密碼子的效率不同。上述問題都是可以解決的。如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用mRNA。定點(diǎn)突變的方法改變可能的終止序列。用E. coli偏愛的密碼子。另外一個(gè)方法，對于小于2kb的基因可以利用化學(xué)合成的片段來代替，利用氨基酸序列作為參考，使用E. coli偏愛的密碼子，并保證不會(huì)有提前

12、存在的終止序列。 9/24/202229歡迎同學(xué)們聽課！偏愛密碼子的問題9/24/202230歡迎同學(xué)們聽課！核糖體結(jié)合位點(diǎn)被遮蔽 9/24/202231歡迎同學(xué)們聽課！二、 E. coli合成重組蛋白的限制利用E. coli作為寄主細(xì)胞合成重組蛋白可能遇到的問題與細(xì)菌的遺傳特性有關(guān)，例如：1） E. coli不能加工成正確的重組蛋白。細(xì)菌和高等生物的加工過程是不同的。特別是一些動(dòng)物的蛋白要進(jìn)行糖基化。糖基化在E. coli中是非常罕見的，在E. coli中合成的蛋白不能正確的糖基化。2） E. coli不能正確的折疊蛋白，形成無活性蛋白。如果蛋白不能進(jìn)行正確的折疊，其三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是不溶的，在

13、細(xì)菌中形成內(nèi)含體。這樣在細(xì)菌中提取蛋白不存在問題，但將蛋白轉(zhuǎn)化為正確的折疊方式是比較困難的甚至是不可能的。9/24/202232歡迎同學(xué)們聽課！3） E. coli可能降解重組蛋白。這一類問題很難解決的，重組蛋白降解的問題可以使用一個(gè)或多個(gè)蛋白酶突變E. coli來解決。正確折疊也可以通過選擇特異的寄主品系來解決。最主要的問題是糖基化的問題，到目前為止仍然是無法解決的問題，只有不需要糖基化的蛋白可以利用這種途徑合成。9/24/202233歡迎同學(xué)們聽課！第三節(jié) 真核生物表達(dá)系統(tǒng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)存在的問題：真核基因的結(jié)構(gòu)具有內(nèi)含子，而大腸桿菌等原核生物沒有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪接加工系統(tǒng)。真核生物m

14、RNA的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌中的不同，影響到真核mRNA在原核細(xì)胞中的穩(wěn)定性及與核糖體的結(jié)合能力。真核生物的基因?qū)啿⒚艽a子的使用偏好與大腸桿菌的不同。大腸桿菌細(xì)胞沒有真核生物的蛋白質(zhì)加工修飾系統(tǒng)，使表達(dá)產(chǎn)物不能正常折疊。大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶會(huì)對真核基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生降解，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。9/24/202234歡迎同學(xué)們聽課！真核基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的對策：克隆真核基因的cDNA或化學(xué)合成不帶內(nèi)含子的基因進(jìn)行表達(dá)。將SD序列（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）引入表達(dá)載體，使之位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游和插入外源基因的上游，保證SD序列與起始密碼子間的準(zhǔn)確距離和堿基組成，防止核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近序列轉(zhuǎn)錄后形成莖環(huán)二級(jí)

15、結(jié)構(gòu)。通過點(diǎn)突變等方法將外源基因中的密碼子轉(zhuǎn)化為大腸桿菌等受體細(xì)胞高頻出現(xiàn)的同義密碼子。9/24/202235歡迎同學(xué)們聽課！真核基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的對策（續(xù)）改變外源mRNA的結(jié)構(gòu)使之不易被核酸酶降解。通過多途徑提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性： a. 改變外源基因的表達(dá)形式； b. 選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌； c. 對外源蛋白中水解酶的敏感位點(diǎn)進(jìn)行修飾或改造; d. 表達(dá)外源蛋白的同時(shí)表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。9/24/202236歡迎同學(xué)們聽課！一、酵母和絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)酵母作為基因表達(dá)受體細(xì)胞的特點(diǎn)：單細(xì)胞真核生物。具有原核生物沒有的蛋白質(zhì)翻譯后的加工和修飾系統(tǒng)?；蚪M全序列的測定已

16、完成，基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)。制比較清楚，遺傳操作相對簡便。不含毒素和特異性病毒，對人體和環(huán)境安全。發(fā)酵工藝成熟，成本低廉。 9/24/202237歡迎同學(xué)們聽課！酵母表達(dá)載體的重要組成元件：復(fù)制起始區(qū)：選擇標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型；顯性選擇標(biāo)記有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達(dá)盒（expression cassette)：啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列和終止子。9/24/202238歡迎同學(xué)們聽課！酵母表達(dá)載體的種類：自主復(fù)制型質(zhì)粒載體整合型質(zhì)粒載體著絲粒型質(zhì)粒載體 酵母人工染色體9/24/202239歡迎同學(xué)們聽課！酵母表達(dá)體系的宿主菌：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）畢赤酵母（ Pichia pas

17、toris，巴斯德畢赤酵母） 乳酸克努維酵母（Kluyaeromyces lacti）9/24/202240歡迎同學(xué)們聽課！在酵母中高效表達(dá)外源基因的策略根據(jù)表達(dá)載體的特性性質(zhì)合適的酵母受體系統(tǒng)。提高表達(dá)載體在細(xì)胞中的拷貝數(shù)及非選擇壓力下保持拷貝數(shù)的穩(wěn)定。提高外源基因轉(zhuǎn)錄水平。9/24/202241歡迎同學(xué)們聽課！目前，高等微生物已經(jīng)成為生產(chǎn)動(dòng)物蛋白的常規(guī)方法。但仍然需要一些載體，動(dòng)物基因的啟動(dòng)子和其他一些表達(dá)信號(hào)在低等的真核生物中并不能很好的、高效的表達(dá)。（一）酵母S. cerevisiae是目前生產(chǎn)重組蛋白的最普遍的真核微生物?？寺〉幕蛞话阍贕AL啟動(dòng)子的控制之下，GAL啟動(dòng)子可以被半乳

18、糖所誘導(dǎo)。S. cerevisiae可以以很高的產(chǎn)量生產(chǎn)蛋白質(zhì)，但不能正確的糖基化動(dòng)物蛋白，9/24/202242歡迎同學(xué)們聽課！也不能將產(chǎn)生的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，這樣需要從細(xì)胞中分離純化蛋白，增加成本。偏愛密碼子也是一個(gè)問題，盡管存在這些問題，S. cerevisiae仍然是應(yīng)用最廣泛的生產(chǎn)重組蛋白的真核微生物。在一定的程度上是因?yàn)?，它是在醫(yī)藥和食品工業(yè)中安全的一種生物體，另外還因?yàn)镾. cerevisiae的生化和遺傳研究已經(jīng)非常詳細(xì)。（二）Pichia pastoris，可以合成大量的重組蛋白（可以達(dá)到總蛋白的30%），而且其9/24/202243歡迎同學(xué)們聽課！糖基化與動(dòng)物非常相似。它

19、所合成的糖化結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的可能不完全相同，但只有細(xì)微的差異，并不影響重組蛋白的活性。重要的是，Pichia pastoris產(chǎn)生的蛋白注入血液后，不產(chǎn)生抗原反應(yīng)。而在S. cerevisiae中，由于過分的糖基化，這樣的問題經(jīng)常會(huì)碰到。Pichia pastoris的表達(dá)載體利用AOX（乙醇氧化酶）作為啟動(dòng)子，可以被甲醇所誘導(dǎo)。9/24/202244歡迎同學(xué)們聽課！酵母對人體蛋白的糖基化 9/24/202245歡迎同學(xué)們聽課！（三）兩種重要的絲狀真菌是Aspergillus nidulans（構(gòu)巢曲霉）和Trichoderma reesei（瑞氏木霉 ）。這些生物的優(yōu)點(diǎn)是：良好的糖基化能力，并能

20、將產(chǎn)生的蛋白分泌到細(xì)胞外。后者是木霉真菌Trichoderma reesei的重要特性，在自然中，它能將分解纖維素的酶分泌到它所生存的木頭上。分泌特性可以簡化重組蛋白的提取。Aspergillus nidulans的表達(dá)載體一般使用葡糖淀粉酶的啟動(dòng)子，可以被淀粉所誘導(dǎo)，被木糖所抑制。Trichoderma reesei使用纖維二糖氫化酶作為啟動(dòng)子，可以被纖維素所誘導(dǎo)。 9/24/202246歡迎同學(xué)們聽課！二、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞也可作為生產(chǎn)動(dòng)物蛋白的重要選擇。這種表達(dá)系統(tǒng)是以baculovirus為基礎(chǔ)的，這種病毒在昆蟲中是非常普遍的，但并不侵染脊椎動(dòng)物。baculovirus的基因組包括多

21、面體基因，他的產(chǎn)物在細(xì)胞中的積累可以在侵染循環(huán)的末期產(chǎn)生大量的核酸包含體。這個(gè)基因的產(chǎn)物占總細(xì)胞蛋白的50%左右，如果該基因被外源基因所取代，但產(chǎn)生的蛋白也有相同的水平。所以，該系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)是，可以產(chǎn)生大量的重組蛋白。9/24/202247歡迎同學(xué)們聽課！最大的問題是昆蟲細(xì)胞是否與哺乳動(dòng)物具有相同的蛋白加工的方式：已有的研究表明，大部分是相同的，但并不總是相同。baculovirus表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值有待于進(jìn)一步的研究。9/24/202248歡迎同學(xué)們聽課！三、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)對于復(fù)雜糖基化結(jié)構(gòu)的蛋白，動(dòng)物細(xì)胞是可以合成有活性蛋白的唯一寄主。但大規(guī)模的連續(xù)的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞存在問題。而且動(dòng)物細(xì)胞的生長速度和最大密度比微生物要低得多，這樣就影響了重組蛋白的產(chǎn)量。哺乳動(dòng)物中應(yīng)用較多的兩個(gè)啟動(dòng)子是人類的熱激啟動(dòng)子：hsp-70基因的啟動(dòng)子，可以在40C的條件表達(dá)；老鼠金屬硫因基因的啟動(dòng)子（mouse metallothionein），培養(yǎng)基中加入鋅鹽可啟動(dòng)表達(dá)。9/24/202249歡迎同學(xué)們聽課！哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體組成特征： a. 啟動(dòng)子 b. 復(fù)制子 c. m