1、分光光度法2022/9/241分光光度法2022/9/2412022/9/2422022/9/242分光光度法的原理Lambert-Beer定律（光吸收定律）溶液的質(zhì)量濃度（C）越大，液層厚度（L）越厚，則溶液對光線吸收得越多。 當入射波長、液層厚度和溶液溫度一定時（即K吸光系數(shù)為定值），溶液對光線的吸收與溶液中吸光物質(zhì)的濃度成正比。 所以可通過測量溶液的吸光度來求得被測組分的含量。 入射光 I0出射光It反射光 IrIa吸收光2022/9/243分光光度法的原理Lambert-Beer定律（光吸收定律）入ItI0 TT （ transmittance ）稱為透光度 ，表示透過光的強度是入射光

2、強度的百分比。AC 光密度與濃度成正比T與C成反比，濃度愈大，T愈小A=- lg=KCL T A （Absorbance）稱為吸光度，指溶液對光線的吸收程度又稱為光密度（Optical density， OD ）。2022/9/244ItI0 TAC 光密度與濃度成正比T與C成反比分光光度法的應(yīng)用用標準管法計算待測液濃度 在相同條件下測定已知濃度（CS）標準液的吸光度（AS），及未知濃度（CU）溶液的吸光度（AU），根據(jù)定律得： AU=KUCULU ； AS=KSCSLS 因為KU=KS， LU=LS 所以AS與AU之比值也等于兩濃度之比值 即 AU/AS=CU/CS ， CU=AUASCS2

3、022/9/245分光光度法的應(yīng)用用標準管法計算待測液濃度AUASCS202分光光度法的應(yīng)用 用標準曲線法求出待測溶液的濃度 先配制一系列已知濃度的測定物溶液，分別測得各管的吸光度。以各管吸光度為縱坐標，測定物含量為橫坐標；在方格坐標紙上作圖即得標準曲線圖。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（g/ml）0.20.40.6.40801201602022/9/246分光光度法的應(yīng)用 用標準曲線法求出待測溶液的濃度吸光度A蛋白分光光度法分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)。特點：分光光度法靈敏度較高、精確度高、操作簡便、快速。分光光度法所使用的光譜范圍主要是波譜圖中2001000n

4、m為一段波長的光譜。 紫外光區(qū)200400nm 可見光區(qū)400760nm 紅外光區(qū)7601000nm2022/9/247分光光度法分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測么么么么方面Sds絕對是假的8么么么么方面Sds絕對是假的8么么么么方面Sds絕對是假的么么么么方面Sds絕對是假的分光光度計的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池測光機構(gòu)鎢絲燈氫燈氘燈棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管 將光能轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔?，光電流的強弱與溶液的吸光量強弱有關(guān)。2022/9/2410分光光度計的基本結(jié)構(gòu)光源單色吸收池測光鎢絲燈棱鏡玻璃比色杯硒2022/9/24112022/9/2411開機，

5、預(yù)熱2030分鐘轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)所需波長。調(diào)零測量并讀數(shù) 結(jié)束/關(guān)機清洗比色杯，收拾好儀器及配件，蓋上防塵蓋，登記儀器使用登記本。2022/9/2412開機，預(yù)熱2030分鐘2022/9/2412分光光度計使用的注意事項試管架或試劑瓶不得放置于儀器上，以防試劑濺出腐蝕機殼。拉桿動作要輕，防溶液濺出，腐蝕機件。比色杯應(yīng)與分光光度計相配對，禁止隨意挪用。比色杯應(yīng)持其側(cè)壁的毛玻璃面。盛液時不能太滿（約達比色杯2/3體積），外壁如有液體，只能用濾紙沾去水份，再用擦鏡紙擦干凈。測畢，比色液一般應(yīng)倒回原試管中，直至計算無誤后方可倒掉。2022/9/2413分光光度計使用的注意事項試管架或試劑瓶不得放置于儀

6、器上，以防原 理大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。這些氨基酸有苯環(huán)共軛雙鍵，在紫外光區(qū)280nm顯示最大光吸收，且吸光度與濃度成正比。蛋白質(zhì)定量紫外分光光度法2022/9/2414原 理大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸試劑配制表（ml）試管012345標準蛋白質(zhì)溶液（1mg/ml）0.51.52.54.01.0（待）蒸餾水4.03.52.51.53.0濃度00.1250.3750.6251A280蛋白質(zhì)定量紫外分光光度法2022/9/2415試劑配制表（ml）蛋白質(zhì)定量紫外分光光度法2022/9/1.標準管法（以第三管為標準管）蛋白質(zhì)定量紫外分光光度法結(jié)果處理A測A標 C標4（稀釋倍數(shù)）C測=2.標準曲線法 以標準管濃度為橫坐標