1、培育細胞的冷凍保存與復(fù)蘇概述冷凍保存與復(fù)蘇的原理冷凍速率冷凍保存溫度復(fù)溫速率冷凍保護劑冷凍保存方法非玻璃化凍存方法主要材料凍存過程凍存結(jié)果爭辯玻璃化凍存方法主要材料凍存過程凍存結(jié)果爭辯凍存細胞的復(fù)蘇非玻璃化凍存細胞的復(fù)蘇主要材料復(fù)蘇過程結(jié)果爭辯玻璃化凍存細胞的復(fù)蘇主要材料復(fù)蘇過程結(jié)果爭辯Polge等人1949覺察了甘油對低溫下貯存的細胞具有保護作用，他們?nèi)耘f以精子進展爭辯覺察，參加甘油能夠大大提高貯存于-790C 下精子的存活率。Luyet1951Lovelock1953等多位學(xué)者覺察了電解電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細胞1961等學(xué)者的連續(xù)和進展。1949 1960 年這一段時間可以稱為冷凍保存

2、的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護劑。Lovelock1959等人覺察了一種的化學(xué)保護劑，這就是人們生疏的二甲基亞砜DMSO。而且，用于冷用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已格外成熟和完備。返回頁首冷凍保存與復(fù)蘇原理在低于-700C 的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反響極其緩慢，甚至細胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫返回頁首冷凍速率如下變化：當細胞被冷至-50C時，因溶液中加

3、有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當被冷至-5-150C 之間時，細胞外溶液先消滅結(jié)冰而一樣：假設(shè)冷凍速度慢，細胞內(nèi)水格外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)即超快速冷凍，則細胞內(nèi)形成的冰晶格外小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)玻璃化冷凍。Luyet1973證明液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子凝固前的狀態(tài)。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為抱負的冷凍方法細胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。1.60C/min、70C/min2022C/min。細胞與細胞之間的最適冷凍速1.60C3000C/min，故對一種細胞進展冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保

4、證獲得最高的冷凍存活率。返回頁首冷凍保存溫度極其緩慢甚至停頓，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的構(gòu)造和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存 -1960C是 目前最正確的冷凍保存溫度。在-1960C 時，細胞的生命活動幾乎完全停頓，但復(fù)蘇后細胞的構(gòu)造和功能完好。假設(shè)冷凍過程得當，一般生物樣品在-1960C 下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C-800C 保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響-400C 范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。返回頁首復(fù)蘇速率冷凍保護體外培育物，除了必需有最正確的冷凍速率、適宜的冷凍保護劑冷凍保存效果。胞存活率。370C 水浴中，于1-2 分

5、鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細胞內(nèi)往往重形成較大冰晶而造成細胞損傷。復(fù)溫時造成的細胞損傷格外快，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。返回頁首冷凍保護劑0.36000C/min 的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而參加甘油冷凍保護劑進展冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類胞過分脫水皺縮DMSO 并不防止細胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護劑DMSO 等成分滲透到細胞內(nèi)，在細胞DMSO 的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要留意的是，DMSO 40C 時，其毒性作DMSO 平衡多40C 4060 分鐘。主要包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。

6、凍保護劑組成保護液。由于很多冷凍保護劑如DMSO在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復(fù)溫后應(yīng)準時洗滌冷凍保護劑。返回頁首冷凍保存方法玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C-800C，然后直接投入液氮進展保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利-1000C 目前細胞凍存最常用的仍是前一種方法。返回頁首非玻璃化凍存方法下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹非玻璃化凍存細胞的具體過程。返回頁首主要材料-300C 低溫冰箱和-700C-800C 超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等；1ml 1.5ml；9 份1 DMSO 混合浴溶解

7、；待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。返回頁首操作過程待凍存細胞懸液的制備算細胞總數(shù)；8001000r/min5min，去上清夜；11061107 個/ml；11.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。分級冷凍先將凍存管放入一般冰箱冷藏室480C，40min；接著將凍存管置于一般冰箱冷凍室-100C-200C，3060min；將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱-300C，30min左右；-700C-800C，過夜；最終將凍存管投入液氮保存。記錄降溫的狀況、凍存位置以及操作人員。返回頁首凍存結(jié)果90%以上。返回頁首爭辯DMSO前，不要對其進展高壓滅菌，因其本身就有滅

8、菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子構(gòu)造，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO 對人體有毒，故在配制時最好帶手套。假設(shè)液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。12 管，以觀看其活力以及是否受到微生物的污染。-1960C37400C 溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶簡潔爆炸而發(fā)生危急。返回頁首玻璃化凍存方法以下以人單核細胞為例說明這種細胞凍存方法Takhashietal. 1986。返回頁首主要材料Hanks20.5%DMSOw/v、15.5% NaOHpH7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。凍存管：SILASTIC3mm4.5mm；設(shè)備：液氮儲存罐；待凍存細胞：人類外周血單核細

9、胞。返回頁首凍存過程用常規(guī)方法分別全血中單核細胞；在冰浴中預(yù)冷冷凍保護液；將裝有單核細胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)冰浴；3min 以 0.3ml/min 5min 0.6ml/min 速度滴加，余下的凍存液以 0.75ml/min 15min左右。輕輕吹吸混勻細胞冷凍懸液；將細胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm 長的凍存管裝 0.8ml 細胞冷凍懸液；將凍存管兩端以火焰封口；最終將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為 6000C/min。返回頁首凍存結(jié)果如此凍存的細胞，其存活率可達 90%以上。返回頁首爭辯玻璃化凍存法對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要簡單的儀器設(shè)復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。40C時毒性大為減弱40C冰浴的時間緩慢滲透到細胞內(nèi)，到達細胞內(nèi)外的平衡。返回頁首凍存