1、小鼠肝Kupffer細(xì)胞別離方法討論【摘要】目的討論別離BALB/小鼠肝Kupffer細(xì)胞(K)的方法。方法采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度離心、選擇性貼壁三步法別離K，并比擬鏈霉蛋白酶、型膠原酶及聯(lián)用鏈霉蛋白酶和型膠原酶等3種不同酶消化別離方法所得K得率及純度。結(jié)果3種不同酶消化別離方法細(xì)胞得率分別為(6.320.5)106g-1，(3.660.4)106g-1，(10.30.7)106g-1；細(xì)胞純度分別為(93.21.7)，(90.71.5)，(94.51.9)。結(jié)論結(jié)合鏈霉蛋白酶和型膠原酶在體灌注和離體消化是別離小鼠K的較好方法?！娟P(guān)鍵詞】肝；枯否細(xì)胞；離心法,梯密度；小鼠，

2、近交BABL；細(xì)胞別離肝Kupffer細(xì)胞Kupfferell,K為定居在肝竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，約占全身單核巨噬細(xì)胞總數(shù)的8090。肝K能吞噬、殺滅病原微生物，去除體內(nèi)的內(nèi)毒素，并具有抗原遞呈、分泌細(xì)胞因子等免疫調(diào)節(jié)作用，同時影響肝細(xì)胞、貯脂細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能1。近期發(fā)現(xiàn)K能誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞凋亡，在調(diào)節(jié)肝移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用2。如何獲得較多數(shù)量和較高純度的K是研究其在機(jī)體中作用機(jī)制的首要條件。而傳統(tǒng)的別離方法往往因數(shù)量和純度缺乏而影響實驗結(jié)果。本試驗采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度、選擇性貼壁三步法別離K，討論別離小鼠肝K的較好方法。1材料與方法1.1材料1.1.1實

3、驗動物BABL/小鼠，雄性，1012周齡，清潔級，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心試驗動物中心提供答應(yīng)證號：046。試驗前禁食12h，自由飲水，隨機(jī)分為3組。1.1.3主要液體的配制1前灌注液Hanks平衡鹽溶液。Kl5l/L,KH2P41l/L,Nal115l/L,HEPES25l/L。調(diào)整pH值為7.4。2后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hanks平衡鹽溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20鏈霉蛋白酶2L；酶消化液：含0.20鏈霉蛋白酶2L、0.012DNAase2L；方法2中的后灌注液含0.025型膠原酶2L。酶消化液：含0.05IV型膠原酶2L；方法3中的后灌注液含0.05型膠原酶

4、1L、0.4鏈霉蛋白酶1L；酶消化液：含0.10型膠原酶1L、0.40鏈霉蛋白酶1L、0.012DNAase2L；1.1.4SPS液的配制100Perll液和8.5%NS以91的比例混合，配制成SPS原液；以70Perll液2L配制：SPS1.4L和PBS0.6L混合配制所得；30Perll液的配制：PBS1.4L和SPS0.6L混合配制所得。1.2BABL/小鼠K別離方法1.2.1原位肝臟灌注步驟參考文獻(xiàn)3。1.2.2肝臟非本質(zhì)細(xì)胞的提取及離心將上述肝細(xì)胞濾液4離心800r/in8in，取沉淀。參加PBS4L，4離心80r/in3in，除去沉淀，取上清。參加PBS4L充分混勻，再次以4離心1

5、50r/in8in，取沉淀。沉淀參加PBS2L,充分混勻。取10L離心管1支，依次參加70Perll、30Perll、細(xì)胞懸液各2L及少許PBS，4離心1600r/in22in。離心管自上而下依次為：細(xì)胞碎片、30Perll層、30Perll層與70Perll層之間的是大量K及少量肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、70Perll層、離心管底層為少許紅細(xì)胞。取30Perll和70Perll層之間的白色物，PBS8L稀釋細(xì)胞，4離心1次600r/in8in，4分別離心150r/in8in2次，除去上清。1.2.3K貼壁培養(yǎng)將上述細(xì)胞沉淀用適量10胎牛RPI1640稀釋，取10L用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性及細(xì)胞計數(shù)，分別

6、計算3種方法的K得率及純度。于37、體積分?jǐn)?shù)為0.05的2孵箱中培養(yǎng)。46h后更換培養(yǎng)液，去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為試驗所需的K。分別于1，24，48h下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁情況。1.3K的鑒定1.3.1熒光顯微鏡觀察將K懸液滴于細(xì)胞玻片上，328n激發(fā)光，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自發(fā)熒光情況。1.3.2吞噬試驗K分別培養(yǎng)6，24h后，參加50碳素墨水2L2h后，洗滌細(xì)胞以除去未吞噬的碳素顆粒，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬情況。1.3.3免疫組織化學(xué)染色常規(guī)免疫組織化學(xué)染色，一抗為兔抗大鼠lyszye，每次試驗均設(shè)置陰性對照組，以0.01l/LPBS代替一抗。1.4統(tǒng)計學(xué)處理計量數(shù)據(jù)以xs表示，采用S

7、PSS11.5統(tǒng)計軟件分析。組間差異用單因素方差分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1熒光顯微鏡觀察在328n熒光激發(fā)下，未見K發(fā)出熒光。2.2K的形態(tài)變化新穎別離的K呈圓形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)少，折光性較強(qiáng)，遠(yuǎn)小于肝細(xì)胞，接種1h后少局部細(xì)胞已貼壁；培養(yǎng)24h后，多數(shù)細(xì)胞已伸展；培養(yǎng)48h后，絕大多數(shù)細(xì)胞已貼壁，且充分伸展，可見星形或不規(guī)那么形；方法3所得K培養(yǎng)24h后的細(xì)胞貼壁及形態(tài)情況圖1A。K:肝Kupffer細(xì)胞.A：K培養(yǎng)24h后的形態(tài)10；B：K培養(yǎng)6h后吞噬試驗10；：K培養(yǎng)48h后免疫組織化學(xué)圖像20.圖1K培養(yǎng)24h后的形態(tài)、6h后的吞噬試驗、48h后的免疫組織化學(xué)表現(xiàn)略Fig1rphusfKafter24hursulture,thephagytsistestfKafter6hursulture,iunhistheistryfKafter48hursulture2.33種方法別離的K活力、得率及純度情況表1。表13種別離方法細(xì)胞得率及細(xì)胞純度的比擬略Tab1parisntheyieldandpurityfKinthreeseparatinethdsn=10.與方法1比擬，：P0.05；與方法2比擬，#：P0.05；與方法1