1、2020生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則、范圍準(zhǔn)確測(cè)立生物基質(zhì)（）這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動(dòng)學(xué).藥動(dòng)學(xué)和生物等效性試 驗(yàn)的結(jié)果做0生物樣品左量分析方法驗(yàn)證和試驗(yàn)樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。應(yīng)該在相應(yīng)的 生物GLP GCP （一）分析方法的完整驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證的主要目的是，證明特泄方法對(duì)于測(cè)怎在某種生物基質(zhì)中分析物濃度的可靠性此外，方法驗(yàn)證應(yīng)采用與試驗(yàn)樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對(duì)每個(gè)新分析方法和新分析物進(jìn)行完整驗(yàn)證。當(dāng)難于獲得相同的基質(zhì)時(shí)，可以采用適當(dāng)基質(zhì)替代，但要說(shuō)明理由。一個(gè)生物分析方法的主要特征包括：選擇性、立量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范用（標(biāo)準(zhǔn)曲線 性能人準(zhǔn)確

2、度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液中儲(chǔ)存和處理全過(guò)程中的穩(wěn)左 件對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)?？?，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)不產(chǎn)生干擾。足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以避免結(jié)果的偏差。1.選擇性6 個(gè)受試者的適宜的空白基質(zhì)來(lái)證明選擇性（動(dòng)物空白基質(zhì)可以不同批次混合），20%,5%時(shí)，通常即可以接受。應(yīng)該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引起 F擾的程度。在適當(dāng)情況下，也應(yīng)該評(píng)價(jià)代謝物在分析過(guò)程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性2 殘 留20%,5%空白樣品，然后分析下一個(gè)試驗(yàn)樣品。定量下限量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，應(yīng)適用于預(yù)期的濃度

3、和試驗(yàn)?zāi)康?。?biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該在指龍的濃度范國(guó)內(nèi)評(píng)價(jià)儀器對(duì)分析物的響應(yīng).獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)加入已知濃度的 分析物（和內(nèi)標(biāo)）到空白基質(zhì)中，制備各濃度的校正標(biāo)樣其基質(zhì)應(yīng)該與目標(biāo)試驗(yàn)樣品基質(zhì)相 同。方法驗(yàn)證中研究的每種分析物和每一分析批，都應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。度范圉，由定量下限和泄量上限（校正標(biāo)樣的最髙濃度）動(dòng)學(xué)。應(yīng)該使用至少 6 個(gè)校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)樣 品） 和零濃度樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)）。每個(gè)校正標(biāo)樣可以被多次處理和分析。算標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線。校正標(biāo)樣回算的濃度一般應(yīng)該在標(biāo)示值的15%20%75校正6 存的校正標(biāo)樣。準(zhǔn)確度分析方法的準(zhǔn)確度描述該

4、方法測(cè)得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度，表示為：（測(cè)得值/真 實(shí)值）xlOO%.分比。應(yīng)通過(guò)單一分析批（批內(nèi)準(zhǔn)確度）和不同分析批（批間準(zhǔn)確度）度。為評(píng)價(jià)一個(gè)分析批中不同時(shí)間的任何趨勢(shì)，推薦以質(zhì)控樣品分析批來(lái)證明準(zhǔn)確度，其樣品 數(shù)不少于一個(gè)分析批預(yù)期的樣品數(shù)批內(nèi)準(zhǔn)確度5 3 75%準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的15%20%范圍內(nèi)。批間準(zhǔn)確度3 5 個(gè)測(cè)左值來(lái)評(píng)價(jià)。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的15%范圍內(nèi)，對(duì)于左 量下限，應(yīng)在標(biāo)示值的20%范圍內(nèi)。報(bào)告的準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證數(shù)摒應(yīng)該包括所有獲得的測(cè)立結(jié)果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤 的情況除外。精密度（濃度質(zhì)控樣品的精密度。4 5 個(gè)樣品。對(duì)于質(zhì)

5、控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超過(guò)15%,20%o3 個(gè)分析批（2 天）的立量下限以及低、中、高濃度， 每5 15%,立量下限的變異系數(shù)不得超過(guò) 20%o 7 稀釋可靠性用空白基質(zhì)稀釋該樣品（5 個(gè)測(cè)定值），度應(yīng)在15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試臉樣品所用的稀釋倍數(shù)。可以通過(guò)部分方法驗(yàn)證來(lái)評(píng)價(jià)稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精密度和準(zhǔn)確度, 也可以接受其使用?；|(zhì)效應(yīng)6 6 批基質(zhì)，但應(yīng)該說(shuō)明理由。對(duì)于每批基質(zhì)應(yīng)該通過(guò)計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面（由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)測(cè)得與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰而積（分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海┍戎?，?jì)算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過(guò)分析物的基質(zhì)因子除以

6、內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從6 批基質(zhì)il15%6 別加入髙濃度和低濃度（3 倍以內(nèi)以及接近定量上限），15%o除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。穩(wěn)定性夠的。（空白基質(zhì)加入分析物至左量下限濃度3 倍以內(nèi)以及接近立量上限15%范圍內(nèi)。穩(wěn)左性檢查應(yīng)考察不同儲(chǔ)存條件，時(shí)間尺度應(yīng)不小于試驗(yàn)樣品儲(chǔ)存的時(shí)間。通常應(yīng)該進(jìn)行下列穩(wěn)泄性考察匚分析物和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液和工作溶液的穩(wěn)定性。從冰箱儲(chǔ)存條件到室溫或樣品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)圧性?；|(zhì)中分析物在冰箱儲(chǔ)存的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。此外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行下列考察。處理過(guò)的樣品在室溫下或在試驗(yàn)過(guò)程儲(chǔ)存

7、條件下的穩(wěn)左性。處理過(guò)的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性。在多個(gè)分析物試驗(yàn)中，特別是對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，應(yīng)該關(guān)注每個(gè)分析物在含所有分析物 基質(zhì)中的穩(wěn)泄性。圧性。（二）部分驗(yàn)證（三）交叉驗(yàn)證15%67樣品測(cè)得的兩組數(shù)值差異應(yīng)在兩者均值的士 20%范圍內(nèi)。三. 試驗(yàn)樣品分析在分析方法驗(yàn)證后，可以進(jìn)行試驗(yàn)樣品或受試者樣品分析。需要在試驗(yàn)樣品分析開始前證 實(shí)生物分析方法的效能。應(yīng)根據(jù)已驗(yàn)證的分析方法處理試驗(yàn)樣品以及質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣，以保證分析批被接受。（-）分析批6 3 平質(zhì)控樣品（5%,兩者中取數(shù)目更多者），分析的試驗(yàn)樣品。所有樣品（校正標(biāo)樣、質(zhì)控和試驗(yàn)樣品）的準(zhǔn)確度和精密度。對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，建

8、議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結(jié)果的變 異。（二） 分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該使用下列接受標(biāo)準(zhǔn)。校正標(biāo)樣測(cè)泄回算濃度一般應(yīng)在標(biāo)示值的15%20%6 個(gè)75%樣，重新計(jì)算不含該標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析。質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的士 15%范圍內(nèi)。至少 67%質(zhì)控樣品，且每一濃度水平 至少50%樣品應(yīng)符合這一標(biāo)準(zhǔn)。在不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的情況下，應(yīng)該拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗(yàn) 樣品應(yīng)該重新提取和分析。在同時(shí)測(cè)立幾個(gè)分析物的情況下，對(duì)每個(gè)分析物都要有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果一個(gè)分析批對(duì) 于一提取和分析樣品，測(cè)定被拒絕的分析物。如果使用多重校正標(biāo)樣，其中僅一個(gè)泄量下限或泄量上限標(biāo)樣不合格，則

9、校正范用不變。15%,（三）校正范圍如果在試驗(yàn)樣品分析開始前，已知或預(yù)期試驗(yàn)樣品中的分析物濃度范用窄，則推薦縮窄標(biāo) 準(zhǔn)曲線范用，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當(dāng)加入質(zhì)控樣品新的濃度，以充分反映試驗(yàn)樣品的濃 度。如果看起來(lái)很多試驗(yàn)樣品的分析物濃度髙于疋量上限，在可能的情況下，應(yīng)該延伸標(biāo)準(zhǔn)曲 線的范闈，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變英濃度。2 析方法應(yīng)被重新驗(yàn)證（部分驗(yàn)證），以確認(rèn)響應(yīng)函數(shù)并保證準(zhǔn)確度和精密度。（四）試驗(yàn)樣品的重新分析和報(bào)告值選擇應(yīng)該在試驗(yàn)汁劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中預(yù)先確左重新分析試驗(yàn)樣品的理由以及選擇報(bào)告值的標(biāo)準(zhǔn)在試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù)的比例。重新分析試驗(yàn)樣品可能基

10、于下列理由。由于校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度或精密度不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致一個(gè)分析批被拒絕。內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著。進(jìn)樣不當(dāng)或儀器功能異常。準(zhǔn)曲線中被拒絕，導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高。在給藥前樣品或安慰劑樣品中測(cè)得可肚量的分析物。色譜不佳。對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，通常不能接受由于藥動(dòng)學(xué)理由重新分析試驗(yàn)樣品。品的身份、初始值、重新分析的理由.重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗(yàn)證時(shí)證明了重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性和進(jìn)樣器內(nèi)穩(wěn)立性, 則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣匚但對(duì)于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。（五）色譜積分并在要求時(shí)提交。（六） 用于評(píng)

11、價(jià)方法重現(xiàn)性的試驗(yàn)樣品再分析在方法驗(yàn)證中使用校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品可能無(wú)法模擬實(shí)際試驗(yàn)樣品。例如，蛋白結(jié)合.已 知和cmax 10%樣品，如果樣2000,5%樣品。67%值的20%I 羽內(nèi)。至少在下列情形下，應(yīng)該進(jìn)行試驗(yàn)樣品的再分析。毒動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，每個(gè)物種一次。所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗(yàn)。首次用于人體的藥物試臉。首次用于患者的藥物試驗(yàn)。首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗(yàn)。對(duì)于動(dòng)物試驗(yàn)，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗(yàn)中進(jìn)行實(shí)際樣品的再分析，例如涉及給藥劑 量和測(cè)得濃度關(guān)系的試驗(yàn)。四. 配體結(jié)合分析配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗(yàn)證原則以及對(duì)試驗(yàn)樣品分析的考慮一般也適用但是由于大分子固有的特點(diǎn)和結(jié)

12、構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提取，所以常常在無(wú)預(yù)先分離的情況下測(cè)左分析物。此外.方法的檢測(cè)終點(diǎn)并不直接來(lái)自分析物的響應(yīng)，而來(lái)自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號(hào)配體結(jié)合分析中每個(gè)校正標(biāo)樣質(zhì)控樣品以及待測(cè)樣品一般都采用復(fù)孔分析如無(wú)特殊說(shuō)明， 本節(jié)以雙孔分析為原則。（-）方法驗(yàn)證前的考量標(biāo)準(zhǔn)品選擇保方法性能不變。基質(zhì)選擇代基質(zhì)建立分析方法。但應(yīng)對(duì)使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明。明基質(zhì)效應(yīng)的消除。最低需求稀釋度的確定分析方法建立與驗(yàn)證過(guò)程中，可能需要對(duì)基質(zhì)進(jìn)行必要的稀釋，以降低其產(chǎn)生的高背景信號(hào)在此情況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提髙信噪比、減少基質(zhì)下擾、優(yōu)化準(zhǔn)確度與精密度而必須使用緩沖液對(duì)

13、生物樣品進(jìn)行稀釋的最小倍數(shù)。應(yīng)使用與試驗(yàn)樣品相同的基質(zhì)來(lái)配制加藥樣品來(lái)確定最低需求稀釋度。試劑因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致性。件進(jìn)行記錄，以確保方法性能長(zhǎng)期不變。（二）方法驗(yàn)證完整驗(yàn)證S 形曲線。6 等距離分布。除校正標(biāo)樣外，可使用錨定點(diǎn)輔助曲線擬合。6 75%的校正標(biāo)樣回算濃度在標(biāo)示值的20% （泄量下限與左量上限在25%）范用 內(nèi)。左量下限與上量上限之間的濃度范用為標(biāo)準(zhǔn)曲線的左量范弗 1受標(biāo)準(zhǔn)。80%20%范（范囤內(nèi)10 80%以上的樣品準(zhǔn)確度在20%（25%范圍內(nèi)）要，可能需要針對(duì)病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)（）考察選擇性。5 （3倍以內(nèi)）、中濃度質(zhì)控（標(biāo)準(zhǔn)曲線中段）、髙濃度質(zhì)控（75

14、%以上）6 3 套質(zhì)控樣品（5 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品）20%（25%20（25%）o （即相對(duì)偏差絕對(duì)值與變異系數(shù)之和）30（泄量下限和左量上限為 40）o法的稀釋線性考察，即評(píng)價(jià)樣品濃度超過(guò)分析方法的肚量上限時(shí)，用空白基質(zhì)將樣品濃度稀 釋至左效應(yīng)，即髙濃度分析物引起的信號(hào)抑制。稀釋線性考察中，稀釋至圧量范圍內(nèi)的每個(gè) QC 樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示 值的20%范圉內(nèi)，且所有 QC 樣品回算終濃度的精密度不超過(guò) 20%。（好釆用超出泄量上限的樣品），3 30%,如果存在樣品稀釋非線性的情況（即非平行性），性考察。67%值的20%a要求對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證在二、（二）和二、（三

15、）中敘述的關(guān)于驗(yàn)證的各項(xiàng)內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。（三）試驗(yàn)樣品分析分析批一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所有樣品均應(yīng)復(fù)孔測(cè)定。試驗(yàn)樣品分析的接受標(biāo)準(zhǔn)75%以上的校正標(biāo)樣（6 個(gè)）示值的20（左雖下限和左量上限為25%）范用內(nèi)。2 3 水平（低、中、髙濃度）67%20% 范陽(yáng)20%50%實(shí)際樣品再分析在3.6 節(jié)中關(guān)于實(shí)際樣品再分析的所有論述均適用于配體結(jié)合分析。再分析樣品的接受標(biāo) 準(zhǔn)為初測(cè)濃度與復(fù)測(cè)濃度都在二者均值的30%范用內(nèi)，再分析樣品中至少以上應(yīng)符合該接受標(biāo)準(zhǔn)五、試驗(yàn)報(bào)告（-）方法驗(yàn)證報(bào)告如果方法驗(yàn)證報(bào)告提供了足夠詳細(xì)的信息，則可以引用主要分析步驟的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題, 否則應(yīng)該在報(bào)告后而附上這些

16、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的內(nèi)容 O應(yīng)該記錄任何對(duì)驗(yàn)證計(jì)劃的偏離。方法驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)該包括至少下列信息。驗(yàn)證結(jié)果概要。所用分析方法的細(xì)節(jié)，如果參考了已有方法，給出分析方法的來(lái)源。摘要敘述分析步驟（分析物，內(nèi)標(biāo)，樣品預(yù)處理、提取和分析）。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品（來(lái)源，批號(hào)，分析證書，穩(wěn)崔性和儲(chǔ)存條件九校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品（基質(zhì)，抗凝劑，預(yù)處理.制備日期和儲(chǔ)存條件）。分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)。分析批所有分析批列表，包括校正范圍.響應(yīng)函數(shù)、回算濃度、準(zhǔn)確度：所有接受分析批的質(zhì)控樣品結(jié)果列表：儲(chǔ)備液、工作溶液、質(zhì)控在所用儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)泄性數(shù)據(jù)：選擇性、 立量下限、殘留、基質(zhì)效應(yīng)和稀釋考察數(shù)據(jù)匚方法驗(yàn)證中得到的意外結(jié)果，充分說(shuō)明采取措施的理由。對(duì)方法或?qū)?biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的偏離。所有測(cè)泄及每個(gè)訃算濃度都必須出現(xiàn)在驗(yàn)證報(bào)告中。（二）樣品分析報(bào)告全部源數(shù)據(jù)應(yīng)該以其原始格式保存，并根據(jù)要求